棉花黄萎菌拮抗细菌BDT-25抗菌蛋白的分离纯化

摘要

拮抗细菌BDT-25菌株是从棉花根际土壤中分离筛选到的一株对棉花黄萎病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahilae Kleb.的生长和微菌核形成具有强烈抑制作用的菌株。经生理生化特征的鉴定，证明BDT-25菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。此外，该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用，为一株广谱拮抗细菌菌株。
　　 采用牛津杯法测定了不同培养温度、培养时间、摇床转速、培养基和pH等培养条件下对拮抗细菌BDT-25抑菌活性的影响，明确了BDT-25菌株产生抑菌物质的最佳培养条件：采用NB液体培养基，在28℃、pH7、170rpm培养48h，所得发酵液对棉花黄萎病菌的生长抑制作用最强。
　　 利用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂对BDT-25菌株的去菌体培养液中的抑菌物质进行提取，结果表明，利用上述有机溶剂所得到的去菌体培养液的提取物无抑菌作用；而经80％硫酸铵沉淀得到的沉淀物对棉花黄萎病菌具有显著的抑制效果。进一步研究表明，该沉淀物对RNA酶不敏感，而对高温、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等敏感，在近中性条件下抑菌活性高而且稳定。该结果说明BDT-25培养液中对V.dahliae具有抑制作用的物质为蛋白质类物质。
　　 BDT-25菌株抗菌蛋白提取液脱盐后，经DEAE-Sepharose Fast Flow分离得到四个组分，经抑菌活性测定得到一个抗菌活性组分，再通过Sephacry S-100凝胶过滤分离得到两个组分P1和P2，经检测表明P1组分对V.dahliae的菌丝生长具有抑制作用，为有效抗菌活性组分。经SDS-PAGE电泳纯化为单一蛋白带，分子量约为30kDa。

目录

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声明

引言

第1章 文献综述

1.1棉花黄萎病的研究进展

1.1.1棉花黄萎病菌的的鉴定及生理分型

1.1.2棉花黄萎病菌致病的机制

1.1.3棉花黄萎病的生物防治

1.2抗真菌蛋白研究进展

1.2.1抗真菌蛋白的分类

1.2.2芽孢杆菌中的抗菌蛋白

1.2.3抗真菌蛋白基因工程研究进展

1.2.4利用抗菌蛋白功能基因进行抗棉花黄萎病育种研究现状

1.2.5研究的目的和意义

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3药品和缓冲液

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1菌株培养

2.2.2 BDT-25菌株鉴定及抑菌谱的测定

2.2.3 BDT-25菌株发酵液对棉花黄萎菌的拮抗作用

2.2.4培养条件对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

2.2.5 BDT-25菌株抗菌物质的提取和性质分析

2.2.6 BDT-25菌株抗菌蛋白的分离和纯化

第3章 结果与分析

3.1 BDT-25菌株鉴定及抑菌谱的测定

3.1.1 BDT-25菌株生理生化鉴定结果

3.1.2 BDT-25菌株抑菌谱的测定结果

3.2培养条件对BDT-25菌株发酵液抑菌效果的影响

3.2.1不同培养时间对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

3.2.2不同培养温度对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

3.2.3不同转速对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

3.2.4不同培养基对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

3.2.5不同pH对BDT-25菌株发酵液抑菌活性的影响

3.3抗菌物质的提取和性质分析的结果

3.3.1有机溶剂提取物的抑菌活性测定的结果

3.3.2 BDT-25菌株抗菌蛋白含量的测定结果

3.3.3 BDT-25菌株蛋白提取液的抑菌活性测定结果

3.3.4 BDT-25菌株抗菌物质部分性质分析的结果

3.4 BDT-25菌株抗菌蛋白的分离和纯化结果

3.4.1 BDT-25菌株抗菌蛋白的DEAE弱阴离子色谱柱预分离结果

3.4.2 BDT-25菌株抗菌蛋白的DEAE弱阴离子色谱柱分离结果

3.4.3 Sephacry S-100凝胶过滤纯化结果

3.4.4抗菌蛋白P1的SDS-聚丙烯酰胺电泳检测结果

第4章 结论与讨论

参考文献

致谢