中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位研究

摘要

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国特有的水产珍品，也是我国一种重要的经济蟹类，广泛存在于我国南北各地淡水水域中。中华绒螯蟹是我国名优淡水养殖业的主要品种。近年来，其养殖业在沿海各地蓬勃兴起，它以优良的生物学品质，极高的营养价值和独特的风味蜚声海内外。养殖业的发展，进一步促进了基础科学研究的发展，而基础科学的发展，又反过来加速了养殖业的蓬勃发展。
　　本文就中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位进行了研究，为其受精生物学、发育生物学方面的深入研究提供参考资料。主要从以下几个方面进行了研究：
　　1．对中华绒螯蟹雄性生殖系统进行解剖，得到贮精囊，进而分离到精荚，利用玻璃匀浆器匀浆的方法，对中华绒螯蟹精荚进行破碎，得到精荚基质和精子；使用两种去污剂对中华绒螫蟹精子膜蛋白进行了提取，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件下，对其精子膜蛋白组分进行了分析，实验结果表明，在双去污剂作用下，提取得到的精子膜蛋白与脱膜精子部分蛋白谱带差异明显；并对提取的精子膜蛋白进行了分子量、等电点和糖蛋白检测，结果显示，所提取的12种精子膜蛋白，其分子量均在lOOku以下，等电点范围在4.4-6.2之间，并均为糖蛋白，说明所提取的中华绒螯蟹精子膜蛋白是低分子量的酸性糖蛋白，这与其他一些哺乳动物精子膜蛋白的研究结果类似；
　　2．乳酸脱氢酶(LDH)尤其是精子特异性乳酸脱氢酶，定位于膜上，也为精子膜蛋白的一种。利用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和特异性染色的方法，对中华绒螯蟹进行了乳酸脱氢酶同工酶电泳分析，实验结果表明，以两种不同底物（乳酸钠和α-，羟基丁酸钠）分别作用于血清、鳃、心脏、肌肉、肝胰腺、成熟蟹精巢、未成熟蟹精巢和精子，实验结果显示，乳酸脱氢酶同工酶具有组织特异性，并且首次在中华绒螯蟹体内发现了精子特异性乳酸脱氢酶，这种酶在中华绒螯蟹精子成熟过程中均存在，并随着精子的成熟，其含量和酶活性逐渐增强，可能在精子成熟过程中起作用：
　　3．利用抽提的精子膜蛋白免疫雌性新西兰白兔，制备多克隆抗血清；利用琼脂糖双向免疫扩散分别对多克隆抗血清活性、效价进行了分析，实验结果表明，制备的多克隆抗血清发生抗原抗体沉淀反应，具有免疫活性，且其效价为1:16;在精子膜蛋白雌雄组织特异性检测中，其实验结果表明，制备的多克隆抗血清与精巢、输精管和贮精囊粗提液发生了明显的免疫沉淀反应，却与雌蟹血清未见有免疫沉淀作用，说明在雄性生殖系统各组织中（精巢、输精管和贮精囊）存在精子膜蛋白，而在雌蟹血清中不含有精子膜蛋白：又对雄蟹不同组织（肝胰腺、心脏、肌肉和血清）进行了组织特异性分析，实验结果表明，制备的多克隆抗血清是组织特异性的；利用免疫印迹法对制备的多克隆抗血清进行了免疫原分析，实验结果表明，在12种精子膜蛋白中，有4种蛋白具有免疫原性：
　　4．利用胶体金免疫电镜技术，结合制备的多克隆抗血清，对中华绒螯蟹精子膜蛋白定位，进行了初步的探索，结果表明，利用胶体金免疫电镜技术，从超微结构水平对精子膜蛋白进行定位。实验结果显示，对照组中，中华绒螯蟹精子结构清晰完整，未见有金颗粒分布：实验组中，在成熟精子中发现，金颗粒散布于精子质膜上：而在未成熟精子中，金颗粒在质膜、顶体膜和核均有分布，推测其中有精子膜蛋白发生转移并参与了精子的成熟过程，尚有待于进一步研究。

目录

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摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 研究现状

1.1.1 几种常见短尾派蟹类精子

1.1.2 精子膜蛋白

1.1.3 乳酸脱氢酶

1.1.4 免疫学方法

1.2 研究目的和意义

第2章 中华绒螯蟹精子膜蛋白制备

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 仪器与设备

2.2.3 药品与试剂

2.2.4 方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 精子膜蛋白提取及其蛋白组分分析

2.3.2 精子膜蛋白几种生化性质检测

第3章 中华绒螯蟹精子特异性乳酸脱氢酶同工酶分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 仪器与设备

3.2.3 药品与试剂

3.2.4 方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 以乳酸钠为底物不同组织乳酸脱氢酶同工酶电泳分析

3.3.2 以α-羟基丁酸钠为底物不同组织乳酸脱氢酶同工酶电泳分析

第4章 中华绒螯蟹精子膜蛋白多克隆抗血清制备与检验

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 仪器与设备

4.2.3 药品与试剂

4.2.4 方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 多克隆抗血清的活性和效价检验分析

4.3.2 多克隆抗血清特异性检验分析

4.3.3 多克隆抗血清免疫印迹检测分析

第5章 中华绒螯蟹精子膜蛋白免疫定位研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 仪器与设备

5.2.3 药品与试剂

5.2.4 方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 精子膜蛋白免疫荧光定位检测分析

5.3.2 精子膜蛋白胶体金免疫电镜定位检测分析

第6章 结语

参考文献

图版说明

致谢

附录