棉花黄萎病拮抗菌的筛选及抗菌蛋白的分离提纯

摘要

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的一种危害性极大的维管束病害，是当前影响我国棉花产量和品质的主要病害之一。
　　 近年来，我国棉花黄萎病不断蔓延，危害逐年加重，被称为“棉花的癌症”。黄萎病在我国广大棉区的猖獗发生，使其已经成为我国棉花生产发展的主要障碍。因为棉花黄萎病是一种土传病害，所以利用物理化学手段进行黄萎病的防治效果甚微。目前许多学者开始主张通过生物防治的途径来防治棉花黄萎病。
　　 本试验从土壤中分离得到了芽孢菌29株，实验室已有113株芽孢菌，共有实验菌株142株。分别将这142株芽孢菌对棉3、V190进行拮抗菌筛选，共筛选出对棉3具有拮抗作用的菌株60株，对V190具有拮抗作用的菌株39株。其中编号为DS45.2的芽孢杆菌对V190表现出很强的拮抗活性。
　　 通过对拮抗菌DS45-2进行生长曲线测定，发现6～12h的种子培养基正处于对数生长期，最适于作种子液。采用不同的培养温度、不同的培养时间、不同的培养基和不同的pH值对拮抗菌DS45-2进行培养，对其发酵液的抗菌活性进行检测，得到了抗菌蛋白产生的最佳条件为：在pH8.0的LBG培养基中30℃摇床恒温培养48h后其抑菌效果最好。
　　 在碳源氮源的优化试验中选择不同种类的碳源，其中包括单糖类（葡萄糖、蔗糖、甘露醇）、双糖类（乳糖、麦芽糖）、多糖类（淀粉、糊精）等分别对拮抗菌DS45-2的发酵培养基进行单因子试验。从试验结果可以看出，拮抗菌DS45-2对单糖（葡萄糖、麦芽糖）的利用效率要明显的高于多糖（淀粉）。确定出最优碳源为葡萄糖，最佳浓度为4％。同法，确定出最优有机氮源组合为0.5％的酵母膏与1％蛋白胨。
　　 对其发酵液进行硫酸铵盐析，发现DS45-2的粗蛋白对棉花黄萎病具有拮抗作用；对其进行有机溶剂（氯仿）处理，发现其抗菌活性消失，初步认定其拮抗物质为蛋白质。通过粗蛋白的热稳定性和pH稳定性试验，发现其对热不敏感，pH6.0～8.0时较稳定。
　　 通过硫酸铵的分级沉淀、DEAE-SephadexA-50离子交换层析和Sepharyl S-300分子筛凝胶层析以及聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，发现DS45-2菌株的发酵液中有多种对棉花黄萎病菌具有拮抗作用的抗菌蛋白。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1棉花黄萎病的发现与危害

1.2棉花黄萎病致病菌

1.2.1种的鉴定

1.2.2生理型的划分

1.2.3寄主范围及症状类型

1.2.4适宜环境

1.3棉花黄萎病致病机理

1.4棉花抗黄萎病机制

1.5棉花抗黄萎病的遗传方式

1.6棉花黄萎病的主要防治途径

1.6.1抗病育种

1.6.2化学药物

1.6.3生物防治

1.6.4抗棉花黄萎病基因工程研究

1.6.5在栽培措施中还可以实行轮作、连作和日晒

1.7研究思路

第2章防治棉花黄萎病的拮抗菌的筛选

2.1材料

2.1.1土样

2.1.2菌种

2.1.3培养基

2.2试验方法

2.2.1样品直接稀释分离法进行细菌分离筛选：

2.2.2倾注法筛选拮抗菌：

2.2.3抗菌物质性质的确定

2.3结果与讨论

2.3.1土壤样品中稀释分离得到的菌株的菌落形态

2.3.2拮抗菌株的筛选

2.3.3抗菌物质性质的确定

第3章拮抗菌DS45-2的菌种鉴定

3.1材料

3.1.1试验菌株

3.1.2试剂

3.1.3培养基

3.2方法

3.2.1群体形态的观察

3.2.2单个菌体形态的观察

3.2.3生理生化试验

3.3结果与讨论

3.3.1菌落特征

3.3.2菌体形态特征

3.3.3生理生化试验

第4章物理参数对拮抗菌DS45-2抑菌效果的影响

4.1材料

4.1.1菌种

4.1.2培养基

4.2方法

4.2.1拮抗菌的发酵培养与活性测定

4.2.2病原菌平板的制备

4.2.3生长曲线的测定

4.2.4发酵条件的研究

4.3结果

4.3.1 DS45-2生长曲线

4.3.2发酵时间的考察

4.3.3发酵温度的考察

4.3.4不同培养基的考察

4.3.5初始pH值的考察

4.4讨论

第5章发酵培养基的优化

5.1材料

5.1.1菌种

5.1.2主要试剂

5.1.3培养基

5.2方法

5.2.1拮抗菌的发酵培养与活性测定

5.2.2病原菌平板的制备

5.2.3培养基优化

5.3结果

5.3.1培养基中碳源种类的筛选

5.3.2碳源起始浓度的确定

5.3.3复合碳源的优化

5.3.4发酵培养有机氮源种类的筛选

5.3.5复合氮源的筛选及起始浓度的确定

5.4讨论

第6章拮抗菌DS45-2粗蛋白部分性质的研究及抗菌蛋白的分离纯化

6.1材料

6.1.1菌种

6.1.2培养基

6.2研究方法

6.2.1粗蛋白的提取及抗菌活性的检测

6.2.2粗蛋白性质的研究

6.2.3抗菌蛋白的纯化

6.3结果

6.3.1粗蛋白性质的研究

6.3.2抗菌蛋白的分离纯化

6.4讨论

结论

参考文献

致谢