维管特异启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体及培育抗黄萎病棉花的方法

摘要

本发明提供了一种维管启动子控制两种抗菌蛋白基因的植物表达载体以及一种培育抗黄萎病棉花的方法。该方法是通过将维管组织特异启动子AAP2控制下的益母草抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2整合到棉花基因组，实现了抗菌蛋白基因在转基因棉花根部维管组织中高量表达，在植株其它部位维管组织中适量表达，显著提高了棉花对黄萎病的抗性。应用这一方法获得的转基因棉花纯合T

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及维管特异启动子控制的抗菌蛋白基因植物表达载体和含有上述表达载体的转基因棉花制备方法；此外，本发明还涉及一种利用基因工程技术提高棉花对黄萎病抗性的方法。

技术背景

棉花是世界上最重要的天然纤维作物。在中国，棉花历来是关系国计民生的重要物资，我国棉花产业涉及约2亿农村人口的收入，关系到1900万纺织工人就业和1000多亿美元的出口创汇，对纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重的作用。但是自1935年棉花黄萎病传入我国后，对我国棉花生产的危害逐年加重，重病年份损失皮棉超过40万吨，直接经济损失达60多亿元(陈捷胤等，2005)。黄萎病为害严重的棉田，产量可减产70％以上，同时还严重降低纤维品质。棉花黄萎病这一世界性的重大病害，严重阻碍着我国棉花生产的发展。棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)属土传维管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、存活时间久，是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。生产上一直没有找到理想的防治技术与控制方法，因此被称之为棉花的“癌症”(陈捷胤等，2005)。由于棉花黄萎病的病原菌危害棉株的维管束，至今尚缺乏有效的防治药剂。选育和推广抗病品种，是我国也是世界各产棉国防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径(顾本康等，1996)。

我国育种专家经过几十年的努力，利用常规育种手段，获得了一些对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种，但是由于黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此就存在着在一个地区表现为抗病的棉种，到另一个不同生理和地理条件下，可能出现抗病性丧失的问题。另一方面，由于陆地棉栽培种内缺乏高抗黄萎病的抗源，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展。此外，不同地域种子交流导致病原菌在地方上的种类越来越多，形成了复合种群。各地的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化和提高，强致病力菌系的出现是造成棉花黄萎病逐年加重的主要原因之一。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题和寻找新的抗病育种方法已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中黄萎病造成的巨大损失。

育种方法上，我国棉花抗枯萎病育种，采用病圃系统选育和有性杂交取得了良好效果，但应用于抗黄萎病育种效果不理想。因此，采用生物技术等多种育种方法，加快抗黄萎病育种进程成为必然。利用现代生物技术分离、克隆和转化抗性基因，可对单一性状进行根本改良，其优点是定向性强、基因型来源丰富、不受抗源亲缘关系限制、育种周期短、理论上不存在性状负相关连锁，一次克隆可用于多次转化。采用基因工程改良植物的抗病性是植物病害防治的一条重要途径(Rommens and Kishore，2000)。

目前，棉花抗黄萎病的基因工程研究已初见成效。成功方面的报道主要集中在几丁质酶基因和β-1、3葡聚糖酶基因，已利用多种鉴定方法筛选转基因后代，获得了抗或耐黄萎病的转基因棉花株系(乐锦华等，2002；吴家和等，2004；程红梅等，2005)。但是，要获得对黄萎病具高抗和稳定持久抗性的棉花资源，还需要进一步寻找新的抗病基因。

通常在抗病基因的选择上，有两种策略。一是利用植物的R(Resistance)基因，R基因虽已克隆近40种，但是R基因表现为抗病品种对病原菌生理小种的专化性抗性，所以其抗病性具有很强的专一性，且容易因病原菌群体生理小种的变化而被克服(Xiaoyan Tang等，1996；Yuelin Zhang等，2003；Caldo R.A.等，2004；John M.McDowell，2003)。二是利用具有广谱与持久抗性的基因。通过这种方式获得的抗病转基因植物，具备能抗多种病害、抗病性不易丧失等优点(Cornelissen等，1993；Osusky M.等，2000)，因此这一策略受到广泛的重视。然而能否筛选出这种具有广谱与持久抗性的基因，也就成为这一策略成败的关键。

抗菌蛋白或多肽(AMP，antimicrobial protein or peptide)是一类由生物产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，广泛分布于动物、植物和微生物中，具有抗菌谱广、抗菌活性高和抗性持久等特点。另外，抗菌肽的抗菌机制特别，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，致使病原菌难以产生抗性(Yeaman等，2003)。不同来源的抗菌蛋白基因广泛地应用于植物抗病基因工程，并获得了抗病性提高的多种转基因植物，使得抗菌蛋白基因在植物基因工程中的应用越来越受到重视。在这一策略中，应用最广泛的是利用来自植物自身的抗菌蛋白提高植物的抗病性。越来越多的研究表明，在转基因植物中表达来自植物的抗菌蛋白可明显提高植物的抗病性。如，Gao等(2000)在转基因马铃薯中超量表达来自苜蓿的抗菌肽基因能明显提高马铃薯对黄萎病的抗性。Ja Choon Koo等(2002)将来自牵牛花种子的抗菌肽基因转入烟草，在烟草中实现其超量表达，可显著提高转基因烟草对黑胫病的抗性。利用抗菌蛋白基因提高棉花黄萎病抗性有为数不多的报道，包括，Fiona Murray等(1999)将来自Talaromyces flavus的葡萄糖氧化酶基因转入棉花中，纯合的T₃代植株对黄萎病抗性得到了提高。Y.Q.Wang等(2004)利用花粉管通道法将来自天麻的抗真菌蛋白基因GAFP导入三个彩色棉栽培种，经两年的育种选择，获得了两个对黄萎病抗性提高的株系。研究表明本发明中利用的益母草抗菌蛋白基因转入烟草和番茄，可明显提高转基因植株对烟草黑胫病，番茄早疫病等多种病害的抗性(XingyongYang等，2007，2008；李先碧等，2007)。

植物基因工程中，控制基因表达启动子的选择上，常常首先选用组成型表达的CaMV35S启动子，实现外源基因超量表达以研究基因的功能，但是该启动子容易造成外源基因表达过高。部分抗菌肽基因过高表达容易引起植株生长发育异常。如，CEMA基因超量表达，易引起转基因棉花叶片畸形和不育(郭余龙等，2003)。Fiona Murray等(1999)将来自Talaromyces flavus的葡萄糖氧化酶基因在棉花中超量表达，纯合T₃代植株对棉花黄萎病抗性增强，但是表达量过高的植株根和种子的生长发育受到影响，根变短、侧根形成减少，种子数量减少，种子萌发率降低。植物基因工程中控制外源基因的表达除了选用CaMV35S启动子外，常常使用诱导型启动子，组织特异表达启动子。抗病基因工程可以根据不同病害的特点，特异表达所需要的目标抗菌蛋白，以抵抗病原菌的侵入或抑制病原菌的生长。如，吴家和等(2004)利用竹节花黄斑病毒启动子CoYMV调控几丁酶基因，实现几丁酶基因在转基因棉花的维管组织内特异表达，达到提高棉花对黄萎病的抗性。Dmytro P.Yevtushenko等(2007)在烟草中诱导表达MsrA2基因，可有效提高转基因烟草的抗性。Rajesh Narhari Patkar(2006)等，利用诱导型启动子PAL调控ns-LTP-like基因在水稻中表达，可有效提高转基因水稻对稻瘟病等多种病害的抗性。

棉花黄萎病菌主要从植株的根部开始侵染，然后随着植株根、茎和叶片各部位的维管组织向植株上部逐渐扩展，条件合适的情况下，可以发展至植株顶部，造成整个植株发病甚至死亡。本发明研究发现若能在棉花维管组织内表达抑制黄萎病菌生长的抗菌蛋白，将黄萎病菌控制在一定范围内，或阻止其在植株内的进一步生长，便能达到抗黄萎病的目的。

发明内容

本发明的一个目的是提供AAP2启动子控制两种抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2的植物表达载体。利用基因工程方法，将AAP2启动子和LjAMP1或LjAMP2抗菌蛋白基因同时构建入适宜的表达载体内，即获得了本发明的AAP2启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体。获得的植物表达载体具有图7P5-AAP2-LjAMP1和图8P5-AAP2-LjAMP2所示的结构特征。将这两个载体分别转入植物内，即可获得维管束特异表达LjAMP1和LjAMP2基因的转基因植物。

本发明的另一个目的是提供同时含有维管特异启动子AAP2和抗菌蛋白基因LjAMP1或LjAMP2的转化体。利用常规的基因工程方法，将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。在本发明的一个具体实施实例中，将植物表达载体通过电击法转入根癌农杆菌LBA4404中即获得了本发明的转化体。此外，利用根癌农杆菌介导法进行转化获得的含有上述重组植物表达载体的转基因细胞系也是该发明的保护范围。

本发明的又一目的是提供一种培育抗黄萎病转基因棉花的方法。本发明所提供的培育抗黄萎病转基因棉花的方法，是利用根癌农杆菌介导法将重组植物表达载体P5-AAP2-LjAMP1和P5-AAP2-LjAMP2导入棉花细胞中，经组织培养和转基因植物分子验证后再生获得对黄萎病抗性提高的转基因棉花。

本发明的目的是这样实现的：一种维管特异启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体，其特征在于，为含有维管特异启动子AAP2控制抗菌蛋白基因LjAMP1的植物表达载体，从拟南芥中提取总DNA后用PCR扩增，再与pMD18载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆得到拟南芥AAP2基因的启动子，该启动子长2131bp，以其取代植物表达载体p5-LjAMP1上的组成型启动子CaMV35S，构建一个新的植物表达体，命名为p5-AAP2-LjAMP1。

一种维管特异启动子控制抗菌蛋白基因的植物表达载体，其特征在于，为含有维管特异启动子AAP2控制抗菌蛋白基因LjAMP2的植物表达载体，以来自拟南芥AAP2基因的启动子取代植物表达载体p5-LjAMP2上的组成型启动子CaMV35S，构建一个新的植物表达体，命名为p5-AAP2-LjAMP2。

进一步，所述的植物表达载体，利用电击法转化根癌农杆菌，获得的含有p5-AAP2-LjAMP2的重组菌。

进一步，所述的植物表达载体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化，获得的含有p5-AAP2-LjAMP2所述植物表达载体的转基因细胞系。

进一步，所述的植物表达载体在制备转基因抗黄萎病棉花中的应用。

进一步，含有p5-AAP2-LjAMP2所述植物表达载体的转基因棉花制备方法，包括下列步骤：

(1)将维管特异启动子AAP2序列、抗菌蛋白基因LjAMP1或LjAMP2序列可操作地分别插入表达载体中，构建植物表达载体；

(2)将步骤(1)所述植物表达载体转入宿主根癌农杆菌，获得转化体；

(3)通过转化体将植物表达载体整合入棉花内，获得转基因棉花。

进一步，一种培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，将上述p5-AAP2-LjAMP2植物表达载体分别转入棉花基因组，实现抗菌蛋白基因在转基因棉花维管组织中特异表达，特别地在根中优势表达，提高棉花对黄萎病的抗病能力。

培育的转基因棉花材料对非落叶型黄萎病病情指数小于15，较野生型对照降低80％以上。

本发明的有益效果在于，利用基因工程技术首先构建了AAP2启动子控制LjAMP1和LjAMP2抗菌蛋白基因的植物表达载体，然后将这些植物表达载体转入棉花基因组。再生植株经严格的分子生物学验证后，4-6片真叶的T₀代幼苗于人工气候室内接种高浓度的落叶型黄萎病菌，经抗性鉴定和筛选获得了抗性提高的T₀代株系。T₁代和T₂代分别于人工气候室和温室病池接种落叶型和非落叶型黄萎病菌，对转基因棉花的抗病性进一步进行鉴定。T₂代抗病鉴定结果显示，苗期转基因株系与野生型对照相比，接种落叶型黄萎病的病情指数可以降低40％左右，接种非落叶型的病情指数可降低80％以上。植株生长后期茎内部组织的病情指数显示，下部茎内部组织的病情指数与对照相比，可以降低60％以上，中部和上部可以降低85％以上。转基因株系植株茎内部组织的变褐现象主要集中在下部茎段的中部维管组织，周围木质部部分没有肉眼可见的病症，而野生型对照植株茎内部各部位都严重褐化。说明LjAMP1或LjAMP2在维管组织内表达可有效抑制棉花黄萎病菌在植株内部滋生，进而提高棉花对黄萎病的抗性。植株生长观察和纤维品质检测的结果表明，LjAMP1和LjAMP2在转基因棉花维管组织内特异表达既不影响植株的生长发育和育性，同时也不影响棉花纤维品质。因此，利用本发明培育抗黄萎病棉花的方法获得的转基因棉花不仅可以提高对黄萎病的抗病能力，而且获得的材料可以应用于棉花生产。

本发明利用来自拟南芥的维管特异启动子AAP2控制抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2，达到抗菌蛋白基因在转基因棉花植株维管组织内特异表达的目的，有效控制棉花黄萎病菌在植株内的进一步侵染和扩展，既能有效控制病害的发展，同时又能减轻甚至消除抗菌蛋白基因过量表达对植株生长发育造成的危害。

本发明方法简便易行，效果显著，获得的抗黄萎病棉花材料可以为棉花抗黄萎病育种提供新的资源，服务于棉花生产，并产生巨大的经济效益。本发明方法不仅适用于培育抗黄萎病的棉花，同样也适用于其它具有维管组织危害特征的抗病材料的培育。

附图说明

图1是pMD18-AAP2图谱。

图2是pBI121-AAP2植物表达载体构建流程图。

图3是AAP2::GUS转基因烟草中GUS基因的PCR部分扩增结果；

M：分子量标记Marker 15；P：以质粒为模板的阳性对照；H₂O：以水代替DNA为模板的阴性对照；1-12：不同的转基因烟草株系编号。

图4是AAP2::GUS转基因烟草GUS组织化学染色结果。

图5是转基因棉花中AAP2启动子的PCR扩增结果；

M15：DNA分子量标记Marker15；1：以质粒为模板的阳性对照；2：以水代替DNA的阴性对照；3-10：不同转基因棉花株系。

图6是AAP2::GUS转基因棉花GUS组织化学染色结果；

A：20d的种子纵切；B：30d的胚；C：幼茎横切；D：叶片；E：根。

图7是P5-AAP2-LjAMP1植物表达载体构建流程图。

图8是P5-AAP2-LjAMP2植物表达载体构建流程图。

图9是pBI121植物表达载体改造为P5载体的流程图。

图10是AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2转基因棉花GUS组织化学染色结果。

图11是AAP2::LjAMP1转基因棉花植株内LjAMP1基因的PCR分析；

bp：碱基对；M：Marker 2000；1：野生型植株对照；2：水阴性对照；3：质粒DNA阳性对照；4-13：GUS阳转基因植株。

图12是AAP2::LjAMP2转基因棉花植株内LjAMP2的PCR分析；

bp：碱基对；M：Marker 2000；1：野生型植株对照；2：质粒DNA阳性对照；3-12：GUS阳性转基因植株；13：水阴性对照。

图13是AAP2::LjAMP1转基因棉花内LjAMP1基因的定量PCR检测结果。

图14是AAP2::LjAMP2转基因棉花内LjAMP2基因的定量PCR检测结果。

图15是人工气候室内接种落叶型黄萎病菌15d，AAP2::LjAMP1转基因棉花T₀代的发病率和病情指数；

WT：再生的野生型植株；AAP2-GUS：空载载体转基因棉花植株；AAP2-LjAMP1-2、AAP2-LjAMP1-3、AAP2-LjAMP1-4、AAP2-LjAMP1-5、AAP2-LjAMP1-6、AAP2-LjAMP1-7和AAP2-LjAMP1-9：AAP2::LjAMP1转基因棉花T₀代株系。

图16是人工气候室内接种落叶型黄萎病菌15d，AAP2::LjAMP2转基因棉花T₀代的发病率和病情指数；

WT：再生的野生型植株；AAP2-GUS：空载载体转基因棉花植株；AAP2-LjAMP2-1、AAP2-LjAMP2-2、AAP2-LjAMP2-3和AAP2-LjAMP2-6：AAP2::LjAMP2转基因棉花T₀代株系。

图17是人工气候室接种落叶型黄萎病菌15d，植株的表型。

图18是人工气候室接种落叶型黄萎病菌15d，植株内部病症。

图19是温室病池接种非落叶型黄萎病菌25d植株的发病率和病情指数。

图20是温室病池接种非落叶型黄萎病菌25d植株的表型。

图21是温室病池接种落叶型黄萎病菌25d植株的发病率和病情指数。

图22是温室病池接种落叶型黄萎病菌25d植株的表型。

图23是接种落叶型黄萎病菌的植株生长后期茎内部组织病情指数。

图24是接种非落叶型黄萎病菌的植株生长后期茎内部组织病情指数。

图25是植株生长后期茎内部组织的病症。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施实例1 植物DNA和RNA的提取

1、植物基因组DNA的提取

选取拟南芥、烟草或棉花(番茄、水稻等均可)植物新鲜组织0.5g，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2％CTAB(W/V)，4％PVP40(W/V)和2％巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/LKAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清液，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min，用玻棒挑出絮状沉淀，75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，风干，重悬于500μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，4℃离心5min)，取上清液，乙醇沉淀。沉淀75％乙醇漂洗后风干，溶于200μL TE中，-20℃保存备用。

2、RNA的提取

选取约3g新鲜棉花植物材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL RNA提取液(2％CTAB(W/V)，2％PVP(W/V)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5g/L Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀，65℃水浴3min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)，取上清液，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h后，12,000r/min，4℃离心20min，弃上清液。沉淀用500μL的SSTE溶液溶解。然后酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)，加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-70℃冰箱沉淀30min以上，12,000r/min，4℃离心10min，弃上清液，沉淀风干。加入200μL的DEPC处理水溶解，保存于-80℃备用。

实施实例2 维管特异启动子AAP2的克隆

1、维管束特异表达启动子AAP2的PCR克隆

根据拟南芥Amino acid permease gene2(AAP2)基因的特点，以拟南芥基因组DNA为模板，序列1和序列2为引物扩增AAP2基因的启动子序列，构建25μL的反应体系为：10×ExPCR buffer(无Mg²⁺)2.5μL；2.5mmol/L dNTPs 2μL；25mmol/L MgCl2(氯化镁)2μL；引物1(5μmol/L)2μL；引物2(5μmol/L)2μL；Ex Taq DNA聚合酶1U；基因组DNA约60ng。

PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min；50℃ 1min；72℃ 2min 30sec(每循环一次温度降低1℃)；94℃ 1min；40℃ 1min；72℃ 2min 30sec(25个循环)；72℃ 10min。

2、扩增产物的回收

PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳定量，用DNA片段回收试剂盒(Roche)回收扩增片段，所有操作均按试剂盒说明书进行。

3、连接和转化

将PCR扩增获得的AAP2回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pMD18-T(TaKaRa)载体(图1)。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，按常规方法筛选阳性克隆，鉴定质粒和插入的片段。

4、序列分析

将获得的AAP2启动子片段进行序列测定，结果表明，PCR所得片段全长2148bp，AAP2启动子片段长2131bp，测序结果见序列11。

实施实例3 维管特异启动子AAP2植物表达载体构建

1、维管特异启动子AAP2植物表达载体构建

为分析AAP2维管特异启动子的表达特性，将AAP2启动子序列取代pBI121载体上的CaMV35S启动子序列，即获得植物表达载体pBI121-AAP2。载体构建流程图见图2。

2、整合pBI121-AAP2表达载体的根癌农杆菌宿主的转化

采用冻融法将pBI121-AAP2植物表达载体导入根癌农杆菌中。具体程序为：将0.5～1μg的质粒DNA加入到100μL感受态细胞中，混匀后冰浴30min。液氮速冻5min后，37℃温浴5min，立即冰浴2min。加入1000μL液体YEB，200r/min、28℃培养3～5h后，离心收集菌体，用100μL液体YEB(5g/L蔗糖+1g/L细菌用酵母抽提物+10g/L细菌用胰化蛋白胨+0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0)重悬菌体并均匀涂布于含125mg/L Sm(链霉素)和50mg/L Km(卡那霉素)的YEB平板。

实施实例4 AAP2启动子在烟草中的表达特点

1、烟草遗传转化用培养基

基本培养基：MSB0(MS无机+B5有机+30g/L蔗糖，pH5.8)。固体培养基加入6g/L的琼脂(Murashige和Skoog，1962；Gamborg等，1968)；

共培养培养基MSB1：MSB0+2.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/L NAA(α-萘乙酸)+6g/L琼脂；

首次筛选培养基MSB2：MSB1+500mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L琼脂；

继代培养基MSB3：MSB1+200mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L琼脂；

生根培养基MSB4：MSB0+0.1mg/L NAA+200mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L琼脂。

2、烟草的遗传转化

(1)转化用农杆菌浸染液的制备

利用划线法获得整合植物表达载体pBI121-AAP2的农杆菌单菌落，然后挑取单菌落接种入附加50mg/L Km和125mg/L Sm 10mL液体YEB，28℃、200rpm培养过夜，然后按5％的比例将菌液接种入20mL不含抗生素的液体YEB，28℃、200rpm培养至OD600约为0.5。取5mL菌液6000rpm离心5min收集菌体，再用5mL MSB0液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。

(2)烟草遗传转化

参照Horsch等(1985)的转化方法并加以改进。具体操作为：

烟草种子0.1％的升汞(HgCl₂)消毒5-8min，无菌自来水冲洗5-6次，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期于固体MSB0萌发约一个月。生长健壮的无菌苗幼嫩叶片，切成约0.5cm×0.5cm的叶盘。农杆菌浸染液浸染叶盘5min。倾去菌液，无菌吸水纸吸去叶盘表面多余菌液，然后接种入铺有一层滤纸的共培养MSB1培养基，25℃暗培养2d。共培养完成后，将叶盘接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期培养2周，然后将叶盘继代入MSB3培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株，并于温室进行繁殖。

3、转基因烟草的PCR验证

以序列3和序列4为引物，各株系烟草基因组DNA为模板扩增GUS基因，以验证GUS基因是否已经整合入转基因烟草植株。25μL扩增反应体系包含约50ng烟草的基因组DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl₂(氯化镁)，5μmol/L的上下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min30sec，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳检测，部分扩增结果见图3。再生获得的20个Km抗性株系中有15个株系扩增获得1810bp左右的特异扩增带，说明AAP2::GUS已经整合到烟草的基因组。

4、转基因烟草中GUS基因的表达特点

参照Jefferson(1978)的方法，以PCR检测为阳性反应的pBI121-AAP2转基因烟草植株幼嫩根、茎、叶、花器官以及种子为材料，切取少许组织放入GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0))进行GUS组织化学染色。结果表明(图4)，AAP2调控的GUS基因主要集中在转基因烟草的根、茎和叶片叶脉等的维管组织内表达。此外，幼嫩种子的表皮也有GUS基因的表达。

实施实例5 AAP2启动子在棉花中的表达特点

1、根癌农杆菌介导的棉花遗传转化常用培养基

基本培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)(T.Murashige，1962；O.L.Gamborg，1968)；

种子萌发培养基：1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH；

共培养培养基：MSB+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+0.1mg/L KT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite(Sigma)，pH5.4；

筛选脱菌培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+500mg/L cef(头孢霉素)+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

愈伤诱导培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

胚性愈伤诱导培养基：MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖，pH5.8；

体胚成熟培养基：MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0；

成苗培养基：SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0。(Schenk & Hildebrandt，1972)

2、棉花遗传转化具体操作方法

(1)转化外植体的获得和农杆菌浸染液的制备

陆地棉种子去壳，籽仁0.1％升汞灭菌10min，无菌自来水漂洗5-6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。

按实施实例4烟草遗传转化农杆菌浸染液的制备方法获得棉花遗传转化农杆菌浸染液。

(2)下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导

外植体用农杆菌浸染液浸染20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。

(3)体胚的诱导和成苗培养

液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d产生大量的体胚，将其继代入SH培养基，促进体胚进一步成苗。3-4叶的再生苗移栽入温室进行繁殖。

3、转基因棉花的分子检测

以再生植株幼嫩叶片为材料提取植株总DNA，并以野生型植株为对照。以DNA为模板，序列1和序列2为引物，扩增AAP2启动子序列。13个Km抗性棉花株系幼苗中有8个株系扩增得到了2000bp左右的特异扩增带(图5)，表明AAP2启动子已经整合到棉花基因组。

4、AAP2启动子在转基因棉花中的表达特点

植物表达载体中利用AAP2启动子控制GUS基因，因此，可以利用GUS组织化学染色法快速地研究AAP2启动子在转基因植株内的表达特点。参照Jefferson(1978)的方法，以PCR检测为阳性的转基因棉花幼嫩根、茎、叶、花器官以及幼胚为材料进行GUS组织化学染色。结果显示(图6)，AAP2启动子控制的GUS基因主要集中在棉花根的中部维管组织内表达。此外，幼胚种子的内种皮上检测到GUS基因的表达，而叶肉细胞、胚芽和子叶中没有检测到GUS基因的表达。

实施实例6 AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2植物表达载体的构建

1、LjAMP1和LjAMP2基因的克隆

纯化的LjAMP1和LjAMP2抗菌蛋白进行N-端氨基酸序列测定，在测序的基础上，利用3′RACE(Schaeler et al.，1995)和YADE(肖月华等，2002)技术克隆其全长基因，见序列12和序列13，并分别将LjAMP1和LjAMP2克隆入pUC-18载体。序列分析表明，LjAMP1含有长为348bp的开放阅读框架，LjAMP2含有长为288bp的开放阅读框架。所有操作均按试剂盒说明书进行。

2、AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2植物表达载体的构建

为了构建AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2植物表达载体，首先利用BamH I和SacI分别双酶切pBI121、pUC-LjAMP1和pUC-LjAMP2载体，以LjAMP1和LjAMP2基因序列分别替代pBI121载体上的GUS基因序列，再利用EcoR I和HindIII分别双酶切pBI121-LjAMP1、pBI121-LjAMP2和P5表达载体，将35S控制LjAMP1和LjAMP2基因的表达元件分别克隆到P5植物表达载体。然后再将目标基因表达元件的35S启动子置换为AAP2启动子，即获得AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2植物表达载体，并分别命名为P5-AAP2-LjAMP1和P5-AAP2-LjAM2。构建流程图见图7和图8。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。

P5植物表达载体为改选常用的pBI121载体而得，改造的流程图见图9。

实施实例7 AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2转基因棉花的获得

P5-AAP2-LjAMP1和P5-AAP2-LjAMP2植物表达载体经电击转化方法转入根癌农杆菌LBA4404后，按照实施实例5的棉花遗传转化和再生方法，将AAP2::LjAMP1和AAP2:::LjAMP2转入棉花基因组。历经Km抗性愈伤、胚性愈伤和体胚的诱导，体胚成苗，然后获得AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2转基因棉花植株。

实施实例8 AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2转基因棉花的分子检测

1、转基因植株的GUS组织化学染色

AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2植物表达载体含有35S启动子控制的GUS基因，因此，转基因植株首先可以利用GUS组织化学染色法进行快速鉴定，转基因植株幼嫩的根、茎和叶片经GUS染液染色后，出现图10所示的蓝色为转基因阳性植株，否则为非转基因植株。

2、抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2在转基因棉花中的PCR分析

以棉花幼嫩叶片为材料，提取转基因植株和野生型植株的总DNA，然后以总DNA为模板，序列5和6为引物扩增LjAMP1基因片段，序列7和8为引物扩增LjAMP2基因片段。PCR扩增采用25μl反应体系进行。

PCR反应25μl总体系，包括1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl₂，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，25ng DNA，1U Taq DNA聚合酶。

PCR反应参数：94℃预扩增5min，然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后再72℃延伸10min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。LjAMP1和LjAMP2的部分扩增结果分别见图11和12。结果表明，所有经GUS检测为阳性的转基因植株都能扩增获得LjAMP1或LjAMP2的目标特异带。

3、抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2在转基因棉花中的定量RT-PCR分析

以二片真叶幼嫩植株根、茎和叶片为材料，分别提取转基因和野生型植株根、茎和叶片的RNA，按说明书合成各样品RNA的一链cDNA，然后以cDNA为模板分别扩增LjAMP1或LjAMP2特异片段。LjAMP1基因的上下游引物分别为序列5和序列6，LjAMP2基因的上下游引物分别为序列7和序列8。以棉花组蛋白HIS3基因为内标。HIS3的引物为序列9和序列10(Zhu YQ等，2003)。

25μL反应体系包含1μL cDNA一链产物，0.2μmol/L特异引物和1×iQ^TM SYBR GreenSupermix。线性扩增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，扩增40个循环。

定量RT-PCR结果表明(图13和14)，LjAMP1和LjAMP2基因在转基因棉花植株内都能有效进行转录表达，并且在根中高量表达，茎中适量表达。野生型植株根、茎和叶内都没有检测到LjAMP1和LjAMP2基因的表达。

实施实例9 转基因棉花对黄萎病的抗病鉴定方法

1、抗病鉴定接种用病原菌的制备

挑取少许固体PDA保存的落叶型和非落叶型黄萎病菌接种入液体PD培养基，180rpm，25℃振荡培养7d，再按10％(菌液/PD培养基)的比例接种入液体PD培养基，180rpm，25℃振荡培养10d，用四层无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁸个/ml，非落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁹个/ml作为接种菌液。

2、人工气候室内抗病鉴定致病菌接种方法

T₀代转基因棉花4-6片真叶，其余世代3-4片真叶，生长相对一致的幼苗植株采用伤根灌菌液法接种致病菌。移栽入盆钵时每株慢慢浇灌菌液100mL，尽量让菌液湿润有棉花植株的土壤团，接种两天后浇透水，以保持盆钵内土壤的湿度。接种后于20℃(夜)-25℃(昼)，湿度80％以上，14h光照/10h暗培养的光周期条件下生长，接种15d按5级病级标准(0级：棉花植株外表无病症；1级：棉株叶片1/3以下显病症；2级：棉株叶片1/3-2/3显病症；3级：棉株叶片2/3以上显病症；4级：棉株叶片全部出现病症，叶片和花蕾脱落严重或植株光杆甚至死亡)统计植株病级，并计算植株的发病率和病情指数。T₀代每次接种均以野生型和空载载体转基因棉花幼苗为对照。其余各世代以野生型和未纯合株系分离的GUS阴性非转基因植株为对照。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。

发病率＝(出现病症植株数量/接种植株总数)*100％；

病情指数＝[∑(病级数*株数)/(4*总株数)]*100

3、温室内抗病鉴定致病菌接种方法

T₂代纯合株系3-4片真叶幼苗移栽入温室时，采用伤根灌菌液法分别接种落叶型和非落叶型黄萎病菌。按2500株/亩的密度栽种，移栽时每株浇灌黄萎病菌液200ml，尽量让菌液湿透营养团，然后于幼苗周围扶湿润土壤，移栽两天后浇透水，以保证温室内幼苗正常生长。接种25d后统计植株的发病率和病情指数。并于植株生长后期将茎杆均分为上部、中部和下部三部分，然后剖杆按5级病级标准(0级：茎内部无变色；1级：茎杆变暗褐色部分占剖面的25％以下；2级：变色部分占50％；3级：变色部分占70％以上；4级：茎杆木质部全部变暗褐色)统计茎杆不同部位内部组织的病级，并计算病情指数。以接种分离于未纯合转基因株系的GUS阴性植株和野生型植株为对照，并设置未接种野生型植株对照。温室内接种试验按随机区组排列，每个材料重复三次，每个重复30株幼苗。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。

实施实例10 人工气候室内转基因棉花T₀代幼苗对黄萎病的抗性

人工气候室内，AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2不同转基因株系植株接种落叶型黄萎病菌15d，部分株系的发病率和病情指数与对照相比，都显著降低，其中AAP2-LjAMP1-5和AAP2-LjAMP2-1株系的发病率和病情指数都为0，AAP2-LjAMP1-4和AAP2-LjAMP2-2的发病率和病情指数都低于50％和50(图15和16)。接种15d，野生型对照植株严重发病，多数叶片脱落，而抗病植株叶片没有病症，叶色鲜绿，生长正常(图17)。转基因棉花植株的发病率、病情指数和病症表明，AAP2::LjAMP1和AAP2::LjAMP2转基因棉花T₀代对落叶型黄萎病具较好的抗性。

以转基因抗病植株的茎段和叶柄为材料，分别对其进行横切和纵切，以同期接种的野生型对照植株的茎段和叶柄为对照，体视镜下观察茎内部组织的病症。结果显示(图18)，抗病植株茎和叶柄内部没有明显的变褐现象，说明这部分植株茎内部没有受到黄萎病菌的侵染或侵染轻微，没有出现明显的病症。而对照植株茎和叶柄内部组织严重变褐，并产生了黑褐色斑块。

实施实例11 转基因棉花T₂代幼苗温室病池对黄萎病的抗性

T₁代幼苗分别于人工气候室继续进行抗病鉴定后，抗病性提高的转基因棉花株系于温室内繁殖，筛选纯合T₂代株系植株，并对这部分株系植株进一步进行抗病鉴定。

一、温室病池内转基因棉花苗期的抗性

1、转基因棉花对非落叶型黄萎病的抗性

纯合T₂代3-4片真叶幼苗温室病池接种非落叶型黄萎病菌25d，接种的野生型植株全部发病，转基因株系的发病率与对照相比，降低60％以上，差异显著(0.01＜P＜0.05)；转基因株系的病情指数与野生型对照相比可降低80.0％以上，差异极显著(P＜0.01)(图19)。说明，LjAMP1和LjAMP2基因在转基因棉花植株维管组织内特异表达可有效提高棉花对非落叶型黄萎病的抗性。接种25d植株的表型见图20，野生型植株叶片都出现了病症，而转基因棉花植株叶片病症不明显或病症轻微。

2、转基因棉花对落叶型黄萎病的抗性

纯合T₂代3-4片真叶幼苗接种落型黄萎病菌25d，野生型接种对照植株全部发病，病情指数达到93.7。转基因植株的病情指数与野生型对照相比可降低40％左右(图21)。说明LjAMP1和LjAMP2基因在转基因棉花植株维管组织内特异表达可以提高棉花对落叶型黄萎病的抗性。接种25d植株的表型见图22，野生型植株因黄萎病菌的感染叶片已出现脱落现象，多数接种的野生型植株因严重发病而死亡，而转基因棉花植株叶片病症不明显或轻微发病，植株生长正常。

二、转基因棉花T₂代植株生长后期茎内部组织表现的抗性

1、转基因棉花对非落叶型黄萎病的抗性

温室病池接种非落叶型黄萎病菌的野生型和转基因株系植株收获纤维和种子后，将植株茎杆均分为上中下三部分，然后纵剖茎段，统计茎内部组织的病情指数，结果见图24。AAP2-LjAMP1-4株系植株下部、中部和上部的病情指数分别为37.5、12.5和12.5，AAP2-LjAMP2-2株系植株分别为50.0、37.5和25.0，都显著低于野生型植株的100.0。结果表明，AAP2-LjAMP1-4和AAP2-LjAMP2-2两个转基因棉花株系对非落叶型黄萎病具有较好的抗病性。

2、转基因棉花对落叶型黄萎病的抗性

野生型植株接种落叶型黄萎病菌后，植株严重发病，叶片脱落后渐渐死亡，这部分植株剖杆后茎上部、中部和下部内部组织的病情指数都达到100.0。而转基因株系接种落叶型黄萎病菌后，多数植株前期轻微发病，植株生长过程中叶片病症没有加重，至后期植株生长正常或下部叶片出现病症。收获纤维和种子后将植株茎杆均分为上中下三部分，茎内部组织的病情指数见图23。AAP2-LjAMP1-4株系植株下部、中部和上部的病情指数分别为62.5、45.0和20.0，AAP2-LjAMP2-2株系植株分别为50.0、30.0和22.5，都显著低于野生型对照的100.0。结果表明，AAP2-LjAMP1-4和AAP2-LjAMP2-2两个株系对落叶型黄萎病具有较好的抗病性。

3、植株生长后期茎内部的病症

温室病池接种落叶型和非落叶型黄萎病菌的野生型对照棉花植株茎内部全部褐化变色。转基因植株茎内部的褐化变色主要集中在植株下部中心维管组织，周围木质部和中上部没有明显的褐色斑点(图25)。植株茎内部的病症说明，LjAMP1和LjMP2在棉花维管组织内特异表达可明显抑制落叶型和非落叶型黄萎病菌在植株内的生长，对黄萎病表现出较好的抗性。

上述实例表明，本发明利用维管特异启动子AAP2控制益母草抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2，实现抗菌蛋白基因在转基因棉花根中高量表达，茎中适量表达，能有效提高转基因棉花对落叶型和非落叶型黄萎病的抗性。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。

序列表

序列1

AAP2启动子克隆引物1：5’-TCTAGAGTTAAACCGAACTATTTTTGATTGCT-3’(30bp)

序列2

AAP2启动子克隆引物2：5’-ACTAGTATGAGAGAAAGAGAAAGAGAGAACA-3’(31bp)

序列3

GUS基因PCR验证引物1：5’-GTCAGTCCCTTATGTTACGTCCTGTAGA-3’(28bp)

序列4

GUS基因PCR验证引物2：5’-GCCAGGAGAGTTGTTGATTCATTG-3’(24bp)

序列5

LjAMP1基因PCR检测引物1：5’-TGCACAATGCTGATCGCG-3’(18bp)

序列6

LjAMP1基因PCR检测引物2：5’-TGGCAAGCGTTTTCAGGC-3’(18bp)

序列7

LjAMP2基因PCR检测引物1：5’-CCAGTTCCGCTCCTGCCAAAG-3’(21bp)

序列8

LjAMP2基因PCR检测引物2：5’-CGATACACCTCCTCGCTCT-3’(19bp)

序列9

棉花HIS3基因扩增引物1：5’-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3’(20bp)

序列10

棉花HIS3基因扩增引物2：5’-CTACCACTACCATCATGGC-3’(19bp)

序列11

AAP2启动子全长序列(2148bp，含添加的酶切位点)

   1 TCTAGACTCA AAAGCTCCAG TCTTAGATAA GGTGAATACA TGGAAGGAAC GGTCAAAGAC GTGTAAGCAG

  71 CCCGGAAAGC AGGTGAAGGG TGTCGCGCAC CCCTTTTAAA TATCGACTTC ACCCTTGAAA GCTCGGAGTA

 141 CACCACAGAT GCATCACTAA AGATTTTGTC GGCACGCTGA AGTAAGCTAT CTCGTGCCTC CTCATAAGCT

 211 GAAGTCTCAC AGTCACTCTC ATCATCGGTG CTTGAGTCTC CTTCTACTAT CAGGGAATAT CCATCAGCCT

 281 GCTTTCTCTA TTCTAGAATA GCTGAAGCAT GTCTTTCAGT AATTACCTTC ATCTGATCTT CAATTGCCGT

 351 GATTAAGTAA CCGTTTTTCT GCGAAAGAAA GAAGATTGAC AACAGCCGTT TGATGGAAAT GAAAGCACCA

 421 GATACACAGA CAAATGCAAC ACATATTCCC TTGGAAAAGG ACAAAAGTAA AAGAGCAGGC AGAAGAGGAG

 491 TACCTGCATA AAGTTGCGGA AAACAGATTT GAAGTCACTG ATTTCCTGCA AAGAGGCATA CTTGTAAACA

 561 GGAGCAGATG GACAACTTTC AGCAGCTGCG ATGCTCATAG TCAAATTCTC ATCAGGTTCC TGGATCATCA

 631 GAAACCAAAT TAGATAGAAC AATAAATAGA AAGAAGGCAA GTTCAAAGAG CAATACCTTA GCAAGCTCCT

 701 CTGGTCTCCC GGCATACATC TGCGGTTGCT CCTGTGGCAT ACGCGAATTC ACTCTTTCAT CATAAGCATT

 771 GCATATTCTA TCAAGCGCAG CCATCTTATC ATCAGCTGTT TGCGGCATCG GACAGACGAA GACATAAGAC

 851 AAACCATCCA TACCAATGCT GCGCACTCGC TCACCGTTGA ATACTATCTC CATGGGCCTC TCATCCTGAC

 921 TATGTTCCTT CAAACGCTGC TGCATCTGCT CTTGCGTATA AAATTCGTCC CCCCTTGATA AGTCGAGCAG

 991 CCAAGAGGAT TTGGCATGGT CTCTGCCCTT CGCATCGTCG TCGTTCTTCG TGGGAATGGC CGGGAGCTTT

1061 CTACGTTTCC ACGGGTAAAG ATCAGAAGAG GAAGGTTTCG CCGGGTAAAG ATCAGAAGAG GAAGGTTTCG

1131 CCGCGGCGGT TGCATCTTCA CCGTCGATTT CATCGTTACA GCGACGCCGG TAATTCCTAG GTTGCTTAGT

1201 TCCCATTCTC TCTCTAAAAT TAGGGCTCGA AATGAATTGT TGAACAAGAT AGAGATCTTT TTCTGATCCC

1271 CGTCGAACAT TTATTCAAGG CCAAAAAAAG CACACGGGAA TTTAGAGTAC CAATACATAT CAAAACCTAA

1341 TGGGCTTTGA ATGGTTGCAT GTGTGTGTTT ATTTCTGATA TGCAAAGCGA TCGATAGTCT TTTCCATACA

1411 AGTGTAAACT GTAAACAACG TAATTAAGCA TAACAATACA ACTCTTTCTT CTCTTTTTTT TTGTAAACAC

1481 AAAATAAAAT TACATCAATT CATGCTTTTC CTAGTTCATC TGACATTTTC CAAAATTCAT GTTCCATTGA

1551 GTCCCTAATA CTTGTTCATA TTCATATTAG GGTACATGAA TAAAAGTTAT CATTCTTGAA ACTACTAAAT

1621 TTTCATAGTT TATTTTTCTT CTTTTCGTTT CACTTTCGAA CAAAACACTA CGCGTGGCAT TTGCAATGAA

1691 TTCCACATTA TATGGAATAA CACCATGATG AACATTCTAC ATATATAATT ATTATGTTTA AGCACTTAGA

1761 CAGCATAAAT TCTTTCTAAT TATATAAATC TAACCTTGTT ACATTGTACA TCTATAAATT ACTTGAAGAA

1831 ATAACGAGTT CTATTTCTTT TTAAAAATTA AAAATACTAT ACCATATCTC AGTGATTAAG TTGAACCAAA

1901 AGGTACGGAG GAGAAACAAG CATTTGATTC TTCCTTATTT TATTTTATTC ATCTCTCACT AATGATGGTG

1971 GAGAAAAAAA GAAAATACCT AACAAACAAA TATATATTGT CATACAAAAA TATTTCTATA TTTTTAGTTA

2051 ATTAGTTTAT ATTCCTCACT TTTCAGGGCT TATATAAGAA AGTGAGCAAA CACAAATCAA AATGCAGCAG

2201 CAAATACTAT CATCACCCAT CTCCTTAGGA TTCCTAGTCA TAACTAGT

序列12

LjAMP1基因全长序列(348bp)

  1 ATGGCTGCCT TGATCAAGTT GATGTGCACA ATGCTGATCG CGGCGGCGGT GGTTGCTCCG TGGCTGAGGC

 71 GGCGATAGGG TGCAACACGG TGGCTTCCAA GATGGCCCCA TGTCTACCGT ACGTCACCGG AAAAGGGCCG

141 CTCGGCGGGT GCTGCGGTGG CGTAAAGGGT CTCATCGAC GCCGCACGGA CCACGCCGGA TAGGCAGGCG

211 GTTTGCAACT GCCTGAAAAC GCTTGCCAAG TCGTACTCCG GCATCAACCT CGGCAACGCC GCCGGACTCC

281 CCGGAAAATG TGGTGTCAGC ATTCCTTACC AGATCAGCCC TAATACTGAT TGCTCAAAGG TGCACTGA

序列13

LjAMP2全长序列(288bp)

  1 ATGCTGCAGG GTCGCCAGTT CCGCTCCTGC CAAAGCTACC TTAGGCAGCG TGGGAATGTT CTAGAAATGG

 71 CCACCGGAAA CCCTCAGTCG CAGACGGTTG AAGAATGCTG CGAGAGTCTG AAGGATATTG AGCGGAAACA

141 GCAGCAATGC GGGTGTGAAG CCATCAAGCA CGCGATGAGG CAGATGCAGG GGGGGCAGAG CGAGGAGGTG

211 TATCGAAAGG CTAGGATGCT GCCACGTACT TGCGGATTAA GGTCACAGCA ATGCCAGTTT AATGTTATCT

281 TTGTGTAG