毛竹AFLP和ISSR标记的序列分析

摘要

扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、微卫星（Microsatellite or Simple Sequence Repeat，SSR）和简单序列重复区间（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）标记具有多态性高和共显性等特点，是毛竹（Phylbstachys pubescens）基因组研究不可缺少的一种重要工具。基于AFLP、ISSR和SSR研究在毛竹上有待开展和加强，本文进行了以下四个方面的研究：
　　 1.克隆和SSR Hunter分析了75个非重复AFLP标记序列，结果显示：（1）序列长度在227bp到900bp之间，平均长度为568bp；（2）双碱基重复三次及以上的位点为76个，三碱基重复三次及以上位点为20个，四碱基、五碱基重复三次及以上的位点分别为3个和1个；（3）三次以上双碱基重复位点GA（TC）出现的频率最高为33个，GT（CA），AT（TA）出现的频率次之为23和20个，GC（CG）重复没有出现；（4）重复碱基出现的比率约为55：1，即每55个碱基中有1个是重复序列中的碱基。
　　 2.AFLP标记序列的BLAST分析结果：（1）28条AFLP标记序列在基因组文库中找到同源序列，相似系数在0.045～4E-93之间，（2）最高同源植物为竹子Arundinaria alpina，其同源基因是类转座子的无功能转座酶基因，相似系数为4E-93；（3）与水稻同源序列最多为12个，分别定位在水稻基因组的1、4、5、8、9、11号染色体，其相似系数介于6.00E-06～3.00E-88之间；（4）6个序列与酿酒葡萄鸟枪序列同源，相似系数在0.011～3.00E-55之间，还与其它植物拟南芥、小麦等的编码序列同源，相似系数在3.00E-06～2.00E-26之间；（5）与动物及人基因组相似序列序列7条，相似系数为0.045～7.00E-09。
　　 3.克隆和SSR Hunter分析49个非重复ISSR标记序列，结果：（1）序列中ISSR序列30条，大小在319和1121bp之间，平均大小为627bp，单测为SSR的序列19条；（2）3、4、5、7次的双碱基重复位点为68、16、7、4个；三碱基重复3、4、5、6次的位点为23、6、2、1个；四碱基重复3、4次的位点为6、1个；六碱基重复3次的位点1个；（3）ISSR序列的双碱基重复排列出现频率为AG（CT）或GA（TC）和GT（AC）或TG（CA）重复位点最多为63和44个，AT（TA）次之为28个，GC（CG）重复位点最少为14个，与AFLP序列显示相同的规律；（4）三次以上重复碱基出现的比率约为25：1，即每25个碱基中有1个是重复中的碱基，其比率比AFLP序列高一倍以上。考虑到两端引物序列，其比率将比AFLP序列高出2～3倍，是一种简单，高效富集SSR的好方法。
　　 4.ISSR标记序列的BLAST比对发现：（1）同源序列25个，同源相似系数在0.04～8.00E-172之间；其中编码序列11个，同源相似系数为0.04～1.00E-35；（2）同源性最高序列为水稻或高粱线粒体基因组，相似系数为8.00E-172；（3）与水稻基因组有19个相似序列，分布在水稻基因组的1、2、3、4、5、7、8、9、11、12号染色体上；（4）除水稻外还与玉米、酿酒葡萄、小麦几种植物同源，相似系数为0.016～1.00E-35。
　　 本研究对毛竹AFLP和ISSR两种分子标记进行了序列分析，得出毛竹基因组中的碱基重复规律：GA（TC）出现的频率最高，GT（CA）、AT（TA）出现的频率次之，GC（CG）重复最少；克隆ISSR序列可以很好的富集SSR位点；BLAST比对发现一些同源序列。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第1章文献综述

1.1 DNA分子标记

1.1.1基于Southern杂交技术的分子标记

1.1.2基于PCR技术的分子标记

1.1.3基于PCR与限制性酶切技术相结合的DNA标记

1.1.4基于单核苷酸多态性的DNA标记

1.2扩增片段长度多态性

1.2.1 AFLP技术原理

1.2.2 AFLP技术流程

1.2.3 AFLP技术的优越性

1.2.4 AFLP技术的应用

1.3微卫星和ISSR标记

1.3.1微卫星

1.3.2 ISSR(简单序列重复区间)特点及其应用

1.4竹类遗传标记的研究进展

第2章毛竹AFLP标记序列分析

2.1材料与试剂

2.1.1所需数据与程序

2.1.2毛竹材料

2.1.3菌株、质粒、培养基与主要试剂

2.2主要实验方法

2.2.1毛竹DNA的提取，纯化与检测

2.2.2感受态细胞的制备

2.2.3基因组DNA的酶切与接头连接

2.2.4 DNA片段的预扩增(Pre-amplification of DNA fragments)

2.2.5 E+3单引物的选择性扩增

2.2.6扩增片段的载体连接与克隆

2.2.7阳性克隆的筛选与测序

2.2.8重复碱基比率计算公式

2.3结果与分析

2.3.1基因组提取、预扩增和选择性扩增结果

2.3.2阳性克隆的检测

2.3.3序列分析

2.3.4 NCBI网站序列比对

2.4讨论

第3章毛竹ISSR标记序列分析

3.1材料与试剂

3.2主要实验方法

3.2.1毛竹基因组的提取

3.2.2毛竹基因组ISSR-PCR扩增体系的建立

3.2.3 ISSR片段的克隆

3.2.4阳性克隆的筛选与测序

3.3结果与分析

3.3.1毛竹基因组ISSR-PCR扩增体系的建立

3.3.2毛竹ISSR引物扩增结果总结

3.3.3菌体PCR筛选检测结果

3.3.4 ISSR标记序列分析

3.3.5 ISSR标记序列的BLAST比对

3.4讨论

第4章结论与创新点

参考文献

附录

致谢