十足目甲壳动物精子发生及顶体反应过程中碱性蛋白和乙酰化H4蛋白的变化

摘要

精子发生过程中，原生殖细胞发育成为精原细胞，再发育为精母细胞，精母细胞经过两次减数分裂成为圆形精细胞，这些圆形精细胞经过细胞变态形成精子。精子发生经历了复杂的细胞分化过程，是以核碱性蛋白在减数分裂前、减数分裂间和精子形成几个显著性过渡为特征的。尤其在精子形成过程中，以核小体为基础的染色质结构转变为以鱼精蛋白为基础的染色质结构是许多脊椎动物包括人类在内精子成熟过程的一大特征，首先出现的是睾丸特异性结合组蛋白，接着组蛋白被中间蛋白取代（主要类型是TP1和TP2），然后再被鱼精蛋白替代，从而导致细胞核染色质凝聚。
　　 精子发生过程中，所有四种核心组蛋白的N末端区域，在某些赖氨酸残基上都会发生可逆乙酰化作用。这些修饰作用与转录的发生、复制时组蛋白沉积及精子发生期间组蛋白的转移相关联。H4是真核细胞中最保守的一种核心组蛋白，从真菌到人类的组蛋白H4，其乙酰化只限制在四个赖氨酸上（残基5、8、12和16）。研究精子发生期间的乙酰化组蛋白H4，可以评估其与基因转录、组蛋白沉积及取代等事件的相关性。
　　 由于人们对甲壳动物精子发生过程中碱性蛋白的变化缺乏系统研究，对其中组蛋白乙酰化作用一无所知，因此我们研究了甲壳动物精子发生过程中碱性蛋白的改变和乙酰化组蛋白H4免疫定位的分布情况，并试图将这些结果与其非浓缩核相联系。
　　 本文以中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、中华绒螯蟹（Eriocheirs inensis）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）三种甲壳动物为主要实验材料，用透射电子显微镜观察了中国明对虾精子发生过程；通过苯胺蓝染色分析了三种甲壳动物精子发生过程中组蛋白的变化；以中国明对虾为代表材料，采用氨银染色和电子显微镜技术相结合的方法，观察精子发生过程中碱性蛋白的分布及变化；通过包埋后免疫电镜定位技术对乙酰化组蛋白H4在三种甲壳动物精子发生过程中的改变进行定位研究；以中华绒螯蟹精子顶体反应为代表，采用乙酰化组蛋白H4包埋后电镜免疫定位技术，观察其顶体反应过程中碱性蛋白的变化。结果如下：
　　 1中国明对虾精子发生过程中存在两种膜复合体，一种起源于细胞核，存在于精母细胞内；另一种起源于细胞质，形成于精子形成后期，并且在成熟精子也存在。
　　 2通过比较常规处理的电镜材料与仅用戊二醛固定和醋酸铀染色处理的电镜材料，发现中国明对虾精子顶体存在大量的脂类物质。
　　 3通过赖氨酸染色，发现三种甲壳动物从精母细胞至圆形精细胞再到成熟精子，细胞核中赖氨酸的特异的兰色反应逐渐减弱，而成熟精子细胞核中仍有微弱的兰色存在。说明尽管精子发生过程中存在细胞核组蛋白的转移，但在成熟精子细胞核中仍然有少量组蛋白的存在。
　　 4通过氨银染色和电子显微镜技术相结合的方法，发现中国明对虾成熟精子细胞核中仍有少量碱性蛋白的分布。
　　 5利用包埋后免疫电镜定位技术对乙酰化组蛋白H4在三种甲壳动物精子发生过程中的改变进行定位研究，发现精原细胞中存在大量乙酰化组蛋白H4，在单倍体精细胞变态时期有大量的乙酰化组蛋白H4从细胞核转运到顶体囊，在成熟精子细胞核中中仍然有一些乙酰化组蛋白H4存在。
　　 6中华绒螯蟹精子顶体反应过程中，通过乙酰化组蛋白H4包埋后免疫电镜定位观察，发现其细胞核中存在乙酰化组蛋白H4。
　　 总之，在所观察的几种十足目甲壳动物精子发生过程中，精细胞变态时期组蛋白发生了从细胞核到顶体的转移，成熟精子细胞核中通过保留和/或替代仍有组蛋白和乙酰化组蛋白H4。成熟精子细胞核中乙酰化组蛋白H4的存在说明仍有DNA转录发生，DNA结构松散，致使细胞核呈现非浓缩状态，这有利于甲壳动物精子顺利完成其受精过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第1章绪论

1.1研究现状

1.1.1精子发生过程中碱性蛋白

1.1.2精子发生过程中的乙酰化组蛋白

1.1.3精子发生过程中乙酰化组蛋白H4

1.2十足目甲壳动物精子发生过程中的碱性蛋白

1.3研究的目的和意义

第2章半薄切片与石蜡切片在中国明对虾精子发生过程中的应用比较

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果

2.3.1石蜡切片法

2.3.2半薄切片法

2.4 讨论

第3章中国明对虾精子发生过程中的膜复合体

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果

3.3.1细胞核起源的膜复合体

3.3.2细胞质起源的膜复合体

3.4讨论

3.4.1细胞核起源的膜复合体

3.4.2细胞质起源的膜复合体

第4章中国明对虾精子形成过程中顶体的发生及其生化组成分析

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1材料

4.2.2原理和方法

4.3结果

4.3.1圆形核精子细胞

4.3.2变态前期精细胞

4.3.3变态中期精细胞

4.3.4变态后期精细胞

4.3.5输精管中精子

4.3.6储精囊中精子

4.4讨论

4.4.1顶体发生与各种细胞器的关系

4.4.2顶体形成中生化组成分析

第5章半薄切片法观察十足目甲壳动物精子发生过程中赖氨酸的变化

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果

5.4讨论

第6章中国明对虾精子发生过程中碱性蛋白的氨银反应

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1材料

6.2.2原理与方法

6.3结果

6.3.1精原细胞

6.3.2初级精母细胞

6.3.3次级精母细胞

6.3.4新形成的精细胞

6.3.5变态前期精细胞

6.3.6变态中期精细胞

6.3.7变态后期精细胞

6.3.8成熟精子

6.4讨论

6.4.1精原细胞中的碱性蛋白

6.4.2初级精母细胞中的碱性蛋白

6.4.3次级精母细胞中的碱性蛋白

6.4.4新形成精细胞中的碱性蛋白

6.4.5变态期精细胞中的碱性蛋白

6.4.6成熟精子中的碱性蛋白

第7章几种甲壳动物精子发生过程中乙酰化H4蛋白

7.1引言

7.2材料与方法

7.2.1材料

7.2.2原理与方法

7.3结果

7.3.1精原细胞

7.3.2初级精母细胞

7.3.3次级精母细胞

7.3.4新生成的精细胞

7.3.5变态前期精细胞

7.3.4变态中期精细胞

7.3.5变态后期精细胞

7.3.6精子时期

7.4讨论

7.4.1精原细胞

7.4.2初级精母细胞

7.4.3次级精母细胞

7.4.4新生成的精细胞

7.4.5变态前期精细胞

7.4.6变态中期精细胞

7.4.7变态后期精细胞

7.4.8精子时期

第8章中华绒螯蟹精子顶体反应过程中乙酰化H4蛋白

8.1引言

8.2材料和方法

8.2.1材料

8.2.2方法

8.3结果

8.3.1光镜观察中华绒螯蟹精子顶体反应

8.3.2中华绒螯蟹精子顶体反应的超微结构

8.3.3乙酰化H4的免疫定位

8.4讨论

8.4.1光镜下的项体反应

8.4.2电镜观察顶体反应的超微结构

8.4.3顶体反应过程中乙酰化H4蛋白

第9章结语

参考文献

图版说明

图版

致谢

附录