假蕈状芽孢杆菌B-60菌株纤溶酶的分离纯化与性质分析

摘要

血栓栓塞性疾病（thrombotic disease，TD）发病率、致残率、致死率皆高，已成为严重危害人类健康的疾病之一。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止，溶栓剂已发展了三代，但依然存在一定的缺陷，仍有待开发安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从微生物中开发出一种新型溶栓剂。
　　 从自然界分离的一株胞外产纤溶酶的芽孢杆菌B-60菌株，通过对它的形态、生理生化特征进行研究，对其16S rDNA序列进行测定与比对，发现芽孢杆菌B-60菌株与假蕈状芽孢杆菌的形态、生理生化特征相符，与其16S rDNA序列也有高达99.38％的同源性。根据多相分类原则，认为芽孢杆菌B-60菌株为假蕈状芽孢杆菌（Bacillus pseudomycoides）。
　　 采用单因子试验和正交试验对产纤溶酶的假蕈状芽孢杆菌B-60的发酵条件进行优化。产纤溶酶最佳条件为：蔗糖15 g/L，豆饼粉15 g/L，MnSO4·H2O3.4 g/L，CaCl23.3g/L，K2HPO4·3H2O0.8 g/L，KH2PO40.2g/L，MgSO4·7H2O7.4 g/L；培养温度32℃，培养基初始pH6.5～7.0，装液量250 mL的三角瓶50 mL，接种量2％～6％，发酵时间56 h左右。Ca2+、Mg2+、K+、Mn2+对酶活有促进作用，Zn2+、Fe2+对酶活有强烈抑制作用。优化后，点样10μL发酵液溶圈直径为19.5mm，溶圈面积为298 m㎡。
　　 利用硫酸铵沉淀和阴离子交换色谱从假蕈状芽孢杆菌B-60菌株中分离纯化出具有纤溶活性的单体蛋白单一组分（BpFE），并对BpFE性质进行分析。BpFE表观分子量为34 kD。它在4℃～50℃活性较稳定，50℃以上活性急剧下降；作用最适pH值为pH5～6，在pH5～10活性较稳定，在pH3.0，活性几乎丧失；金属离子Ca2+，Mg2+，Mn2+对酶活有轻微促进作用，Cu2+则强烈抑制酶活。苯甲基磺酰氟（PMSF）完全抑制它的活性。BpFE经胰蛋白酶和胃蛋白酶降解后，活性上升。N端15个氨基酸序列为VTGTN AVGTG KGVLG，比对结果表明，BpFE N端氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽杆菌和乳杆菌的bacillolysin，neutral protease，hydrolase的一部分序列同源性为100％。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第1章绪论

1.1血栓的形成及溶解机制

1.1.1血栓形成机制

1.1.2血栓溶解机制

1.2溶栓药物的研究进展及前景展望

1.2.1溶栓药物的来源

1.2.2溶栓药物的发展历程

1.2.3现有溶栓药物的主要缺陷

1.2.4新型溶栓药物的开发及发展趋势

1.3微生物溶栓药物研究概况

第2章纤溶酶产生菌株B-60的鉴定

2.1材料与试剂

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3试剂

2.2方法

2.2.1纤溶活性测定

2.2.1 B-60菌株的鉴定

2.3结果与讨论

2.3.1纤溶活性测定

2.3.2分类鉴定

第3章假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的发酵条件优化

3.1材料与试剂

3.1.1菌株

3.1.2培养基

3.1.3试剂

3.2方法

3.2.1菌株培养方法

3.2.2种子生长曲线绘制及产酶高峰

3.2.3纤溶酶活性的测定

3.3结果与分析

3.3.1 B.pseudomycoides B-60菌株种子生长曲线与发酵时间

3.3.2 B.pseudomycoides B-60菌株发酵培养基组成的优化

3.3.3发酵条件的优化

3.4讨论

第4章假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的蛋白分离纯化及性质

4.1材料与试剂

4.1.1菌株

4.1.2培养基

4.1.3试剂

4.2方法

4.2.1 B.pseudomycoides B-60菌株蛋白提取物的制备

4.2.2初步鉴定B.pseudomycoides B-60菌株提取物的成分

4.2.3 B.pseudomycoides B-60蛋白的分离纯化

4.2.4检测分离效果和目标蛋白的相对分子质量(Mr)

4.2.5 B.pseudomycoides B-60纤溶酶(BpFE)的N-端氨基酸序列测定

4.2.6蛋白质浓度标准曲线和尿激酶活力标准曲线的制作

4.2.7 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较

4.2.8 BpFE的最适温度和最适作用pH值

4.2.9蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响

4.2.10金属离子对BpFE活性的影响

4.2.11胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpFE的作用

4.3结果

4.3.1纤溶活性成分的鉴定

4.3.2 DEAE阴离子交换色谱

4.3.3 BpFE N-端序列

4.3.4 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较

4.3.5 BpFE的温度适应性和酸碱稳定性

4.3.6蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响

4.3.7金属离子对BpFE活性的影响

4.3.8胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpEE的作用

4.4讨论

第5章结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢