绒白乳菇和点柄乳牛肝菌中体外抗肿瘤活性成分的筛选及其作用机制研究

摘要

目的:对从绒白乳菇和点柄乳牛肝菌中分离到的12个化学成分进行体外抗肿瘤活性筛选，并进一步探讨抗肿瘤活性较强的化学成分的抗肿瘤作用机制及对小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞因子分泌的影响，为从该类化合物中开发出新的抗肿瘤药物提供科学依据。
　　 方法:
　　 1.采用MTT法测定12个高等真菌的化学成分对A549（人肺腺癌细胞株），HCT-8（人结肠癌细胞株），Bel-7402（人肝癌细胞株）SMMC7721（人肝癌细胞株），HeLa(人宫颈癌细胞株)5株人肿瘤细胞的细胞毒活性：采用0.01，0.1，1，10，100 μg/mL的样品终浓度，测定作用24h、48h、72h后的肿瘤细胞生长抑制率；
　　 2.对筛选出的抗肿瘤活性较强的成分-乳菇素D（Mitissimol D）进一步进行抗肿瘤作用机制的研究。采用倒置显微镜、光学显微镜观察Mitissimol D作用后HeLa 细胞的形态学变化、FDA/PI 双染荧光显微镜观察Mitissimol D作用后HeLa 细胞的死亡情况、琼脂糖凝胶电泳观察DNA的梯形条带，采用流式细胞仪检测其对HeLa 细胞周期、凋亡率的影响；3、采用MTT法检测Mitissimol D 对小鼠静止及丝裂原激活的脾淋巴细胞增殖的影响并采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其对脾细胞白细胞介素-2（IL-2）产生的影响。
　　 结果:
　　 1.筛选的12个高等真菌的化学成分中Mitissimol D对A549、Bel-7402、SMMC7721和HeLa细胞的体外增殖有显著的抑制作用，其作用72h后的IC50分别为2.46μg/mL 、19.09μg/mL、18.21μg/mL、17.05μg/mL，均小于20 μg/mL，且具有较好的时效量效关系；对HCT-8抑制作用较弱（IC50为137.26μg/mL）；
　　 2.倒置相差显微镜下观察到在Mitissimol D作用后24h开始HeLa细胞连接消失、细胞变圆，脱落，随着作用时间的延长细胞脱落逐渐明显，至作用后48h后全部脱落，且细胞皱缩，体积变小，细胞浆内出现大量颗粒； 姬姆萨染色观察到Mitissimol D可诱导HeLa细胞出现典型的凋亡形态：核固缩、染色质固缩集聚，细胞膜泡沫化；FDA-PI双染荧光显微镜下观察，Mitissimol D可诱导HeLa细胞死亡，且随着剂量的增大，死亡细胞数明显增加；琼脂糖凝胶电泳检测到Mitissimol D浓度10μg/mL作用于HeLa细胞48h后可见凋亡梯状条带；流式细胞仪检测发现：Mitissimol D可以诱导HeLa发生凋亡，且具明显的时效和量效关系，HeLa细胞有很低的自然凋亡率，Mitissimol D以浓度1、10、100μg/mL作用于HeLa细胞24h后凋亡率分别为2.17％、4.1％、18.75％，48h后凋亡率分别为5.3％、5.5％、23.3％，72h后凋亡率分别为10.43％、20.22％、32.14％，与对照组(1.74％、3.58％、4.98％)比较，凋亡率显著增高（P <0.05或P <0.01）。细胞周期分布表明MitissimolD可引起S期和G2期阻滞，且有时间剂量依赖性；
　　 3.对免疫细胞功能的影响：对静止的脾细胞增殖没有明显的影响。对于丝裂原活化的脾细胞的增殖在作用后有明显的抑制作用，并抑制丝裂原激活的脾淋巴细胞分泌IL-2。
　　 结论:
　　 1.Mitissimol D能抑制体外人肿瘤细胞的增殖，且呈时间剂量依赖性；
　　 2.Mitissimol D抗肿瘤作用机制可能与诱导凋亡细胞及细胞周期的S 及G2期阻滞有关具有良好的开发成为抗肿瘤药物的潜能；
　　 3.Mitissimol D对静止的小鼠脾细胞的增殖没有明显的抑制作用，但对丝裂原活化的脾细胞的增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与干预细胞因子的表达有关。