血浆循环DNA完整性及多基因甲基化对肺癌诊断价值的研究

摘要

背景：肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，是我国发病率和致死率最高的癌症之一。由于诊断手段的限制大多患者在确诊时已发展到中晚期，错过了最佳的治疗时机。实现肺癌的早期诊断且进行有效地治疗成为提高患者存活率的关键。循环DNA样本的取得实时、无创为肺癌的早期诊断带来了福音。
　　目的：通过分子生物学的手段发现灵敏度和特异性高的外周血生物标志物是工作的关键。我们对血浆循环DNA进行两方面的研究：一是评价血浆循环DNA完整性对肺癌诊断的价值。二是探讨血浆循环 DNA甲基化与肺癌的相关性。
　　方法：制备重组质粒标准品，建立实时荧光定量检测血浆DNA水平的方法，分别检测78例肺癌患者、78例健康人血浆中长度为102bp和377bp的β-actin(ACTB)片段水平，并分析血浆DNA的完整性（ACTB377/ACTB102）。利用受试者工作特征曲线(ROC)评价血浆循环DNA水平及完整性在肺癌诊断中的价值。采用多重置换扩增(Multiple displacement amplification，MDA)技术联合巢式甲基化特异性PCR(nest methylation specific PCR，nMSP)法，检测78例肺癌患者、78例健康人血浆样本中基因启动子区的甲基化状态。
　　结果：建立了检测循环 DNA水平的可靠方法。肺癌患者循环DNA长、短片段的水平均显著高于健康对照组（P<0.0001），ROC曲线下面积(AUC)分别为0.833、0.742。肺癌患者血浆循环DNA完整度（0.2082±0.1328）高于健康对照组血浆 DNA完整度（0.07796±0.0386），差异具有统计学意义，ROC曲线下面积(AUC)为0.912。肺癌患者血浆DNA水平与年龄、淋巴结转移情况、肿瘤大小等临床病理参数均无相关性。血浆样本中 CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9、RUNX3基因启动子甲基化率分别为53.85％(42/78)、42.31%(33/78)、51.28%(40/78)、37.18%(29/78)、21.79%(17/78)。CDH13、DLEC1、RASSF1A、SEPT9组合对肺癌的诊断效能明显高于其他组，准确度 ACC为81.41%，Youden指数为0.6282（灵敏度为80.77%，特异度为82.05%）。
　　结论：本方法检测的血浆循环DNA水平及DNA完整度对肺癌的诊断准确性较高，联合其他血清标志物有望应用于肺癌的诊断及高危人群的筛查。血浆多基因联合甲基化检测有望应用于肺癌早期诊断中。

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第1章 前 言

第2章 肺癌循环DNA完整性定量检测及其临床意义

2.1 引言

2.2 材料与试剂

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验试剂

2.2.3 试剂配制

2.2.4 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 目的基因的克隆

2.3.2 质粒标准品的构建及鉴定

2.3.3 绝对定量标准曲线的建立与评价

2.3.4 血浆循环DNA的提取及定量检测

2.3.5 统计学分析

2.4 实验结果

2.4.1 PCR扩增产物的鉴定

2.4.2 重组质粒测序鉴定

2.4.3 绝对定量标准曲线的建立与评价

2.4.4 肺癌血浆循环DNA水平及完整度的临床诊断价值

2.5 讨论

第3章 血浆中多基因联合甲基化检测在肺癌诊断中的应用

3.1 引言

3.2 材料与试剂

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验试剂

3.2.3 试剂配制

3.2.4 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 基因组DNA的提取

3.3.2 基因组DNA的修饰

3.3.3 修饰后的DNA进行全基因组扩增

3.3.4 巢氏甲基化特异性PCR

3.3.5 结果判断及统计学分析

3.4 结果

3.4.1 MDA全基因组扩增结果

3.4.2 五种基因的甲基化电泳检测结果

3.4.3 血浆中各基因甲基化率统计

3.4.4 血浆中各基因甲基化状态与临床病理特征的关系

3.4.5 血浆中多基因联合甲基化检测的灵敏度和特异度

3.4.6肺癌患者和健康人血浆中 CpG岛甲基化表型( CIMP)的比较

3.5 讨论

第4章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果