基于新型信号检测技术的蛋白激酶活性分析方法研究

摘要

蛋白激酶在细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程的调控中起着十分重要的作用。其活性的异常会导致许多疾病的产生，因此对蛋白激酶活性的分析与研究对于临床诊断以及靶向药物的研制都具有重要的意义。相关领域的研究迫切需要开发灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低廉的检测蛋白激酶活性的新方法。本论文以蛋白激酶 A（PKA）为研究对象，采用Zr4+修饰的功能化磁性微球为磷酸化多肽识别载体，创新性利用上转换荧光以及便携式血糖仪等新型信号检测机制，建立了灵敏检测蛋白激酶活性的方法。主要研究内容如下：
　　1.将Zr4+修饰在Fe3O4/SiO2磁性微球表面。生物素（Biotin）标记的底物多肽在蛋白激酶存在时特定的氨基酸残基将被磷酸化，多肽上的磷酸基团与Zr4+特异性结合，而被富集在磁性微球表面；同时多肽一端标记的 biotin与表面标记有亲和素（Avidin）的上转换发光纳米粒子特异性结合。因此，蛋白激酶的活性与磁性微球上富集的上转换发光纳米粒子呈正比关系。通过对磁性微球表面的磷酸化多肽进行洗脱并检测溶液中的上转换荧光强度，即可实现蛋白激酶活性的高灵敏度检测。该方法对蛋白激酶活性检测范围为0.05 mU/μL到0.2 U/μL；检出限为0.02 mU/μL。
　　2.基于常用的便携式血糖仪，建立了一种简单、快速测定蛋白激酶活性的方法。同样以 Zr4+修饰的磁性微球为磷酸化多肽富集载体，在其表面富集蛋白激酶催化产生的biotin-磷酸化多肽，经由链霉亲和素（Streptavidin）介导而进一步捕获 biotin-蔗糖转化酶，激酶活性与磁性微球表面的biotin-蔗糖转化酶正相关，蔗糖转化酶催化蔗糖水解产生葡萄糖，用便携式血糖仪检测溶液中葡萄糖的含量，从而间接测得蛋白激酶的活性。本方法的检测范围为0.1 mU/μL到0.2 U/μL。以简单价廉的便携式血糖仪实现了高灵敏度蛋白激酶活性分析。

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第1章 引 言

1.1 选题背景与意义

1.2 蛋白激酶的概述

1.3 蛋白激酶的功能

1.4 蛋白激酶活性的检测

1. 4. 1 基于磁性微球及荧光技术的蛋白激酶活性分析

1. 4. 2 基于电化学方法检测蛋白激酶的活性

1. 4. 3 基于抗体识别技术检测蛋白激酶的活性

1.5 论文主要研究内容

第2章 以上转换发光纳米粒子为探针的蛋白激酶活性分析

2.1 前言

2.2 实验部分

2. 2. 1 实验试剂和仪器

2. 2. 2 实验步骤

2.3 实验结果与讨论

2. 3. 1 检测 P KA活性的原理

2.3.2 PKA活性的测定

2.3.3 PKA抑制实验

2. 3. 4 细胞样品中P KA活性分析

2.4 本章小结

第3章 基于便携式血糖仪检测蛋白激酶活性

3.1 前言

3.2 实验部分

3. 2. 1 实验试剂和仪器

3. 2. 2 实验步骤

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 PKA活性的测定原理

3. 3. 2 体系中ATP浓度的优化

3.3.3 PKA活性的检测

3.3.4 PKA抑制剂的筛选

3.3.5 Src活性的测定

3.3.6 MCF-7细胞中PKA活性测定

3.4 本章小结

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的论文