黄花蒿紫穗槐二烯合酶T296位点突变对其功能的影响

摘要

萜类化合物是自然界天然次生代谢产物的重要组分之一。截至目前，人们已经从各种生物中分离鉴定了70，000多种萜类化合物，这种数量和结构的多样性得益于萜类合酶及环化酶的催化多样性。随着大量有价值的萜类不断被发现，促进了萜类合酶结构和功能的研究，在理论方面加深了对萜类合酶的作用机理的理解，了解结构与功能的关系，在应用中指导了酶的理性设计和新药物的开发。萜类化合物研究中的核心问题之一是生物体产生出数量众多的结构多样化的萜类化合物的机制探究，很大程度上依赖于萜类环化酶催化特异性的机制研究。实验室研究团队以黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ADS)为模型，以多种倍半萜合酶，环化酶为研究对象，结合生物信息学和分子生物学手段，利用点突变和中间产物饲喂法探索酶的结构和催化路径等问题。
　　本文围绕T296V突变的显著效应展开进一步研究。对T296位点的突变发现当该点突变成V以后改变了主产物，同样催化底物FPP（法尼基焦磷酸）原紫穗槐二烯（环化）产量大幅下降，而线性非环化的法尼烯成了新的主产物。推测并实验证实这一转变是酶关键位置的残基体积改变造成的，具体来说，该氨基酸处在疏水口袋“门口”位置，和疏水口袋的封口有关系，突变造成了封口的不完整和底物结合取向的变化。将RNPP（R构型橙花叔基焦磷酸）作为底物时，T296V突变的催化主产物又恢复90％原主产物紫穗槐二烯，这意味着RNPP作为底物弥补了296位点突变为V对ADS的影响。而从催化路径的角度来讲，证明了T296V催化FPP生成紫穗槐二烯受阻的位点。其二，针对V的突变效应的假设，即认为苏氨酸的羟基起了关键作用也因为296A突变体的催化产物所质疑，推测仅仅是侧链体积的影响。随后对296这一位点多个氨基酸进行突变，催化产物的种类和量的变化说明了T296这个邻近催化口袋空腔“入口”处的位点的突变对酶活性造成影响。此外，针对同物种的同源酶法尼烯合酶（AaFs，主产物法尼烯）的对应位点V324进行T突变是为了试探该关键位点在催化中的角色作用是否具有普遍性，借此推测物种进化选择的特性。

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第1章 绪 论

1.1 倍半萜合酶的研究概要

1.1.1 萜类化合物与萜类合酶简介

1.1.2 萜类合酶的催化机制

1.1.3 植物倍半萜合酶研究进展

1.1.4 紫穗槐二烯合酶的研究进展

第2章 实验材料与技术

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 主要实验仪器

2.2 实验技术

2.2.1 制备大肠杆菌感受态细胞

2.2.2 快速定点突变与突变PCR体系和产物转化

2.2.3 质粒提取

2.2.4 蛋白质纯化

2.2.5 酶体外催化反应

第3章 紫穗槐二烯合酶T296位点突变对其功能的影响

3.1 实验材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 方法

3.2 结果

3.2.1 突变质粒的测序验证

3.2.2 突变质粒下游表达蛋白的电泳验证

3.2.3 突变蛋白的功能鉴定

3.2.4 T296V突变体催化产物分析

3.2.5 T296位点和邻近位点的互作

结语

参考文献

致谢