青蒿紫穗槐二烯合酶C-末端截短和两个关键区域突变对其功能的影响

摘要

萜类是植物天然代谢产物的重要组成部分,迄今为止,人们已经从自然界各种生物中分离鉴定了55,000多种萜类化合物,其数量和结构的多样性都是由萜类环化酶的活动引起的。随着大量有价值的萜类不断被发现,对萜合酶的研究也变得更加有意义,不仅在理论方面可以帮助我们更好地理解萜合酶的催化机理,了解其结构与功能的关系,而且在应用方面对开发新的药物也具有重要意义。萜类化合物的研究中最令人感兴趣的问题是生物如何特异性产生出数量如此众多的萜类化合物。而萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决此问题的关键。本文围绕倍半萜合酶催化机理做了以下工作:
　　1.为探讨C-末端对酶活性的影响,对青蒿紫穗槐二烯合酶(Amorpha-4,11-diene synthase of Artemisia annua ADS)C末端进行了系列截短(6、7、8、9、10、14、29个氨基酸),发现:C-末端截短6个氨基酸(C6),活性有所下降,C7几乎丧失活性,C8-C10能保持微弱活性,而C14和C29活性完全丧失。这些结果表明,虽然C-末端没有参与活性中心的形成,但是其结构对维持酶的活性起重要作用。
　　2.为研究G螺旋纽结对ADS活性的影响,对螺旋处的G400、G401、A402、L405进行单突变和联合突变,除A402外,其余单点突变均改变了酶的产物特异性。G401A突变造成γ-humulene和amorpha-4,7(11)-diene比例增多,推测G401跟最终产物的去质子化有关。而 G400A只造成γ-humulene比例增多,G401A和G400A双突变amorpha-4,7(11)-diene和γ-humulene比例与G401相比进一步增加,显示共显性作用。T399L造成 amorpha-4,7(11)-diene比例增加,T399L和G401A双突变中γ-humlene消失,amorpha-4,7(11)-diene比例增加,说明T399L抑制γ-humulene生成,表现出上位效应。L405A突变后侧链变短造成口袋变大,使第二次环化无法完成,但并不影响异构化和第一次环化反应。而且水分子容易进入活性中心,形成倍半萜醇。
　　3.对ADS RXR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(R,E)-Nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。

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第1章 绪 论

1.1 植物倍半萜合酶研究进展

1.2 青蒿紫穗槐二烯合酶研究进展

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

第3章 紫穗槐二烯合酶C-末端截短对其功能的影响

3.1 菌株、载体和试剂

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 紫穗槐二烯合酶G螺旋纽结突变对产物特异性的影响

4.1 菌株、载体和试剂

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 紫穗槐二烯合酶RXR基序突变对产物特异性的影响

5.1 菌株、载体和试剂

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论和结论

结论

参考文献

致谢

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