基于生物酶技术的黑骨藤皂苷类成分提取工艺及抗炎活性评价研究

摘要

黑骨藤是萝摩科杠柳属植物西南杠柳（Periploca forrestii Schltr.）的根茎，是贵州特色苗药。常用于治疗类风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调，骨折等。目前，黑骨藤的研究大部分集中于化学成分和药理活性，课题组前期对黑骨藤的研究中发现黑骨藤抗炎效果与其皂苷类成分有密切联系。皂苷类成分的研究包括药理活性、生物转化、生源合成等，其中，生物转化研究主要集中于对目标化合物活性位点的结构修饰以及提取等方面，将生物转化技术应用于黑骨藤中皂苷类成分的研究有利于对黑骨藤资源的开发利用。
　　结合本课题组前期对黑骨藤的研究，该实验采用生物酶辅助提取的方法提高了黑骨藤中皂苷类成分提取率，并采用响应面法对酶解工艺进行优化和验证，随后对酶辅助提取物进行了药效学考察，并指认出黑骨藤中指标性成分绿原酸，建立了绿原酸HPLC含量测定方法，具体如下：
　　1采用紫外分光光度法，建立了黑骨藤中皂苷类成分的含量测定方法，借助已建立起来的方法从19种商品酶中筛选出能显著提高皂苷类成分提取率的复合酶（纤维素酶和果胶酶），可比传统提取方式提取出的皂苷类成分提取率多出55％，随后在单因素考察基础上结合Box-Behnken中心组合响应面法优化酶提取工艺，得出最佳提取条件组合为酶解温度51.97 oC，pH=3.5，复合酶用量1.55%，复合酶配比为果胶酶：纤维素酶=8:2，通过验证和扩大实验考察结果显示良好。该方法为进一步更好的利用黑骨藤中的有效成分提供了参考。
　　2建立完全弗氏佐剂性关节炎大鼠模型，对酶辅助提取物与传统提取方式提取物进行药效学验证对比考察。该实验以大鼠踝关节直径和足掌厚度、体重、踝关节浸出物PGE2含量、胸腺、肾上腺、脾脏脏器系数为评价指标，对比观察传统提取和酶辅助提取出的皂苷类成分对AA大鼠的影响，最终确定酶辅助提取物可有效提高黑骨藤抗类风湿关节炎的药效作用且效果优于传统提取方式提取物，为黑骨藤抗类风湿性关节炎的扩大应用提供了科学依据。
　　3指认出黑骨藤中指标性成分绿原酸并确定其为原型入血成分，以绿原酸含量为指标采用正交设计实验优化了黑骨藤前处理工艺，结果为提取温度70 oC，提取1 h两次，溶剂为60%甲醇，溶剂体积为10 mL，随后采用C18色谱柱对黑骨藤中绿原酸进行分离，结果表明在流速为1 mL·min-1，流动相为乙腈：0.5%甲酸水=9:91的情况下回收率可达98.569%。该方法方便快捷，回收率及精密度良好，为黑骨藤质量控制研究提供了依据。

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序言

第一章 文献综述

1.1 黑骨藤化学成分，药理作用及应用

1.2 生物转化技术发展与应用

第二章 黑骨藤中皂苷类成分含量测定研究

2.1 仪器与试剂

2.2 实验方法

2.3 方法学考察

2.4 讨论

第三章 基于生物转化的黑骨藤中皂苷类成分研究

3.1 仪器与试剂

3.2 实验方法

3.3 酶提取工艺优化

3.4 实验结果与讨论

第四章 药效学验证研究

4.1 实验仪器及试剂

4.2 实验动物

4.3 受试药物

4.4实验方法

4.5实验结果

4.6 结论

第五章 黑骨藤中绿原酸含量测定研究

5.1 实验仪器与试剂

5.2 实验方法

5.3 入血成分的含量测定

5.4 方法学考察

5.5 讨论

第六章 结论与展望

6.1 实验结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

致谢

附录

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