灵芝多糖的提取纯化、结构表征及灵芝茶的质量控制研究

摘要

灵芝（Ganoderma lucidum(Leyss. exFr.) Karst）是多孔菌科灵芝属的一种药用真菌，始记载于《神农本草经》，现收载于《中国药典》一部（2015版）。灵芝具有多种功效，可用于免疫紊乱、肿瘤、高血压、慢性肝炎、肾炎、胃溃疡等疾病的防治。灵芝具有多种活性物质，其中以灵芝多糖的研究最为广泛深入。但由于灵芝多糖结构复杂、溶解性差等原因，阻碍了灵芝多糖生物活性及灵芝产品深入开发研究。因此，本研究拟以灵芝子实体为研究对象，对灵芝多糖的提取工艺及灵芝茶的质量控制开展了一系列深入研究，为进一步验证灵芝多糖的药理活性、促进灵芝相关产品的开发研究提供更为深入的科学依据。
　　围绕上述科研目标，本文主要从以下几个方面开展研究：首先，以2015版《中国药典》中收载的灵芝正品——赤芝为研究对象，采用酶辅助超声波-微波联用提取法，以灵芝多糖得率为评价指标，优化得出灵芝多糖的最佳提取工艺；其次，通过Sevag法除蛋白、DEAE-52离子交换纤维素柱层析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对灵芝粗多糖的进行分离纯化，最终得到多糖纯化组分，并采用HPLC-RID、HPLC-DAD、FT-IR等方法对多糖纯化组分进行结构表征；最后，对灵芝产品——灵芝茶的生产工艺及质量控制方法进行研究，获取灵芝茶的最佳生产工艺参数，并制订灵芝茶质量控制方法。取得主要研究成果如下：
　　（1）基于酶辅助超声波-微波联用提取法的灵芝多糖提取工艺研究
　　为了获取灵芝多糖的最佳提取工艺参数，本研究以赤芝为研究对象，以多糖得率为评价指标，采用酶辅助超声波-微波联用提取法提取灵芝多糖。通过对酶的筛选，提取条件单因素试验考察，结合响应曲面设计，对灵芝多糖提取工艺进行系统的优化研究。研究结果显示，对灵芝多糖提取效果最好的生物酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的复合酶（比例为1:1:1）。在此基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，建立了灵芝多糖得率与超声时间、酶活力、溶剂用量及酶解温度的二次多项式数学模型，得到最佳提取工艺参数为：超声时间为49min，酶活力为1000U，溶剂用量为22mL，酶解温度为38℃。在此工艺参数下，灵芝多糖得率高于传统热水提取法106.9％。
　　（2）灵芝多糖的分离纯化及结构表征
　　以灵芝粗多糖为研究对象，采用Sevag法、DEAE-52离子交换纤维素、Sephadex G-100葡聚糖凝胶对灵芝粗多糖进行分离纯化，最终得到多糖的纯化组分，并采用HPLC-RID、HPLC-DAD、FT-IR等方法对多糖纯化组分进行结构表征。研究结果显示，灵芝粗多糖经分离纯化处理后，最终得到三种多糖纯化组分GLP-D1-1、GLP-D2-1和GLP-D2-2。通过HPLC-RID分析，发现组分三种多糖组分均具有均一的分布特性，其重均相对分子量（Mw）分别为6.542×104 Da、2.007×105Da、1.055×105Da。通过HPLC-DAD分析结果表明，GLP-D1-1的单糖组成及摩尔比例为D-甘露糖:鼠李糖:D-半乳糖醛酸:葡萄糖:D-半乳糖:L-岩藻糖=6.89:1.00:0.05:16.32:8.53:0.80；GLP-D2-1的单糖组成及摩尔比例为D-甘露糖:鼠李糖: D-葡萄糖醛酸: D-半乳糖醛酸:葡萄糖: D-半乳糖: L-岩藻糖=1.54:1.00:0.01:8.59:0.98:0.17；GLP-D2-2的单糖组成及摩尔比例为D-甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:D-半乳糖=0.77:1.00:11.28:0.66。通过FT-IR红外光谱分析，发现三种多糖组分都具有典型的多糖特征键及葡聚糖特有光谱信号，且组分GLP-D2-1和 GLP-D2-2可能为β-型葡聚糖。
　　（3）灵芝茶的生产工艺及质量控制研究
　　采用单因素结合响应曲面设计优化研究灵芝茶的生产工艺，得出灵芝茶的最佳生产工艺参数为：灵芝提取物用量0.93g，烘烤时间61min，烘烤温度79℃。以此配方制备的灵芝茶在响应面法中感官评价得分预测最大值为87.2，实测值为86.1，比市售的灵芝茶得分（75.6）高出10分以上。
　　采用超高效液相色谱串联质谱法建立灵芝茶中灵芝酸A和灵芝酸B含量测定方法。该方法中，灵芝酸A浓度在0.0513～0.5130μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为99.57%（RSD=2.74%，n=9）；灵芝酸B浓度在0.0208～0.1247μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为101.9%（RSD=1.08%，n=9）。采用紫外分光光度法建立了灵芝茶中茶多酚和多糖含量测定方法，该方法中，没食子酸浓度在4.08～16.50μg·mL-1范围内线性良好，平均回收率为99.6%（RSD=2.52%,n=9）；葡萄糖浓度在40.33～181.50μg·mL-1范围内线性良好，平均回收率为100.5%（RSD=1.08%,n=9）。综上所述，灵芝茶质量控制的研究可对灵芝茶工业化生产提供了一定依据，能有效促进灵芝类及茶叶类相关产品的开发利用。

目录

本文主要缩写符号说明

本文主要仪器说明

序言

第一章 文献综述

1.1 灵芝的化学成分及药理活性研究进展

1.2 灵芝多糖的药理作用

1.3 多糖的提取方法

1.4 多糖的分离纯化研究

1.5 多糖的含量测定与结构分析

1.6 小结

第二章 基于酶辅助超声波-微波联用提取法的灵芝多糖提取工艺研究

2.1 试验材料与试剂

2.2 试验方法

2.3 数理统计方法

2.4 结果与讨论

2.5 小结

第三章 灵芝多糖的分离纯化及结构鉴定

3.1 试验材料与试剂

3.2 试验方法

3.3 数理统计方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第四章 灵芝茶生产工艺优化研究

4.1 试验材料与试剂

4.2 试验方法

4.3 数理统计方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

第五章 灵芝茶的质量控制研究

5.1 试验材料与试剂

5.2 试验方法

5.3 结果与讨论

5.4 小结

第六章 结论与展望

6.1 试验结论

6.2 创新点

6.3 不足之处

6.4 展望

参考文献

致谢

附录

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