茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激机制研究

摘要

酿酒酵母对高温发酵工艺有复杂的应激反应，能产生促进细胞呼吸和修复作用的保护性物质，称为活性酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative,简称LYCD)，有重要的医用和美容价值。LYCD的主要活性成份包括大量的应激蛋白、多肽和氨基酸，但各种成份的功能和应激机理尚不明确。分析LYCD中的主要应激蛋白及功能，有助于揭示茅台酒的高温发酵机理和酿造工艺条件的优化。
　　论文建立了酵母细胞高温和酒精共同刺激的茅台酒高温发酵条件实验模型，确定高温和酒精刺激产生高活性LYCD的条件为温度46℃，酒精浓度为4％(v/v)，作用时间20min；对LYCD中的应激蛋白进行了分离提取和纯化，制定了蛋白样本制备的方案。采用分级提取LYCD中蛋白的方法，先提取大部分可溶性蛋白，再逐级提取微溶和难溶蛋白，样本中加入不含蛋白酶的DNase/RNase除杂，使用试剂盒对蛋白精确定量，保证相同上样量，确保实验的可比较性；摸索了双向电泳分离蛋白的最佳方法和实验条件，实现了蛋白的分离。通过7cm胶条预实验确定了双向电泳选用pH3～10非线性胶条，能在pH5～7之间得到较高的分辨率，充分均布酵母蛋白。一向电泳在20℃被动水化8h和50V电压主动水化4h后，逐步升压最终在8000V电压下充分聚焦72000VHrs。二向SDS-PAGE时采用溴酚蓝琼脂糖凝胶显示电泳进度，电泳结束用银染方法使蛋白固定和显色，银染的蛋白上样量小灵敏度高，利于低丰度蛋白的检出。
　　使用Image Master 2D Platinum 5.0二维凝胶电泳图象分析系统对蛋白胶图进行分析，获得综合三块平行胶的虚拟凝胶，比较分析了应激反应的差异蛋白，得出了10个含量差异3倍以上的蛋白点和13个有无差异点。
　　最终选取14个蛋白差异点做质谱分析，软件搜索质谱结果获得蛋白点的详细信息，初步鉴定了8种蛋白，与应激反应密切相关的蛋白有乙醇脱氢酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶和细胞色素C过氧化物酶。其他5种蛋白与细胞周期或信号传导有关，分别是核糖体的组成蛋白、结构蛋白，烯醇酶，磷酸甘油酸变位酶和肌动蛋白。乙醇脱氢酶是酵母体内酒精的主要防御机制；细胞色素C过氧化物酶是催化以过氧化氢氧化还原型细胞色素c反应的过氧化物酶；S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是一种利用甲硫氨酸和ATP合成SAM的酶，SAM是谷胱甘肽合成的前体；烯醇酶有热激蛋白的功能。实验表明茅台酒高温发酵工艺中酵母的应激反应机制是产生主要活性成分的机理之一，高温堆积发酵顶温控制在46～50℃具有很强的科学性。

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1 前 言

1.1 茅台酒高温发酵工艺

1.2 高温发酵工艺对酿酒酵母的要求

1.3 酵母对高温发酵工艺的应激反应

1.4 应激反应活性酵母细胞衍生物

1.5 应激蛋白分析方法

1.6 论文的研究目的、意义及内容

2 材料与方法

2.1 材料与仪器设备

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 供试菌株性能分析

3.2 高温和酒精共同刺激

3.3 蛋白浓度的计算

3.4 预实验 7cm 胶条

3.5 正式实验 18cm 胶条

3.6 胶图分析

3.7 质谱分析蛋白点的选取

3.8 质谱分析结果

4 结论

4.1 酵母细胞高温和酒精共同刺激制备高活性 LYCD 的最佳条件

4.2 双向电泳分离蛋白方法的优化

4.3 酵母高温发酵工艺应激反应机理的初步研究

4.4 LYCD 中应激蛋白与茅台酒高温发酵工艺的相关性评价

5 展望

致谢

参考文献

附录

图版Ⅰ

图版Ⅱ

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