山羊痘病毒某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因的研究

摘要

山羊痘是由羊痘病毒属（Capripoxvirus）山羊痘病毒（Goat poxvirus，GPV）引起的一种高度接触性传染病，临床上以体温升高，全身皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为主要特征。本病被世界动物卫生组织（OIE）列为A类重大动物传染病，我国也将其列为一类动物疫病。2002年10月以来，贵州省羊群中首次暴发疑似山羊痘病例，并迅速波及到8个养羊较为集中的地区，对我省养羊业的健康发展构成了巨大的威胁。为了防制本病，本研究对我省两株山羊痘病毒分离株进行了某些生物学特性及其主要结构蛋白P32基因进行了详细研究。
　　将贵州省山羊痘病毒分离株GPV-LD和GPV-QL接种Vero-E6、BHK-21细胞，3～7d感染细胞显现圆缩、聚集成簇等细胞病变效应；以GPV荧光抗体对感染细胞飞片染色，在细胞浆中检测到特异性的黄绿色荧光；取感染细胞超薄切片进行电子显微镜观察，细胞浆中发现大量成熟和未成熟的痘病毒颗粒；将感染细胞培养物提取总DNA样本，采用针对P32结构蛋白基因和ITR非编码区基因的两对引物进行PCR鉴定，分别扩增出969bp和289bp的DNA片段，对目的DNA片段的测序结果证实感染细胞培养物中存在GPV特异性的病原核酸；采用2000TCID50的病毒感染细胞培养物通过皮下接种3月龄健康山羊，在14～45d成功复制出与山羊痘自然病例相类似的临床症状和剖检病变，并从感染组织材料中回收到接种的病毒。
　　对GPV结构蛋白P32基因和非编码区ITR基因的两对引物进行比较，以期开展临床山羊痘病例的定性PCR检测。研究结果表明两对引物具有羊痘病毒属特异性，不与副痘病毒属羊传染性脓疱病毒、禽痘病毒属鸡痘病毒、健康山羊皮肤样本发生交叉反应。贵州分离毒P32基因和ITR基因与国内外参考毒株的核苷酸同源性分别达99.5％～100％和100％；PCR最小检出量分别为19.06ng和24.40ng。为此，ITR基因引物更适合于临床山羊痘病例的诊断，而P32基因则有利于病毒囊膜表面蛋白的深入研究。
　　根据GPV参考毒株的全基因序列，针对gp064基因分别设计与合成了TaqMan-MGB探针和引物，应用实时荧光PCR方法开展对山羊痘病例的定量检测。一般PCR方法只能检测患羊出现痘疹病变的皮肤和黏膜材料，而FQ-PCR方法则能够从患羊鼻腔拭子、血液样本、皮肤、肺、胃、淋巴结等组织材料中检出GPV病原核酸。按照本试验构建的标准曲线，TaqMan-MGB-FQ-PCR方法的检测极限为0.1TCID50的病毒量。检测结果表明在人工复制山羊痘病例中，不同组织的含毒量呈现皮肤>瘤胃>肺>淋巴结的趋势；接种山羊从第9～15d形成病毒血症，持续时间较短；鼻拭子中从第7～22d均能检测到病毒的存在，表明患羊痘疹痂皮和鼻分泌物是山羊痘蔓延扩散的主要传染源。应用FQ-PCR方法在皮肤痘疹病变出现之前3～5d即可检测病毒的增殖动态，为山羊痘的早期诊断提供了实用的技术。
　　对山羊痘现场自然病例和人工复制病例进行病理形态学观察，患病羊群的大体病变以皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为特征；病变部位上皮细胞增生、变性，同时出现巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性白细胞等炎性细胞浸润；受害细胞胞浆内观察到线粒体肿胀、内质网扩张、高尔基复合体扩张甚至破裂。在感染细胞的胞浆中观察到大量成熟和未成熟的痘病毒颗粒，包括形态较大，被膜完整或不完整，呈C形或花瓣状的初期病毒颗粒；在中央或偏中央部位开始形成致密类核体的中期病毒颗粒；和形态较小，有囊膜包裹，中央可见两面凹陷呈哑铃形核酸芯髓的成熟期痘病毒颗粒。
　　将GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P32基因克隆至pMD18-T载体，重组质粒测序和序列分析显示，GPV贵州分离株之间核苷酸同源性高达99.9％，与国内其它GPV分离株的核苷酸同源性达到99.7％～100％，与国外GPV分离株核苷酸同源性达到99.5％～99.6％。系统发生树分析显示羊痘病毒属中SPV与LSDV之间亲缘关系较近，聚为一类，而它们与GPV亲缘关系较远，后者聚为一类，不同毒株之间表现出明显的种间差异和地域关系。P32蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构分析结果表明，GPVP32蛋白基因在肽段227-251区域存在一个潜在的优势抗原表位。
　　以pMD18-T-P32/LD质粒为模板，扩增P32基因不同长度的片段并克隆至表达载体，构建原核重组表达载体和真核重组表达载体，转化至相应的宿主菌中进行诱导表达。结果表明，P32基因N端1/3片段和中间1/3片段未能通过原核表达载体pET-28a、毕赤酵母真核表达载体pPICZαA在各自宿主菌BL21(DE3)、X-33中获得表达；而P32全基因在两种表达系统中均获得了良好的表达，SDS-PAGE和Western-Blotting分析显示表达蛋白分子量分别为35.5KD和64KD。表达蛋白通过Ni柱亲和层析和Sephadex G-100层析获得纯化，该纯化蛋白在琼脂扩散试验中与山羊痘阳性血清出现特异性的沉淀线，而与阴性血清不发生反应；采用纯化蛋白接种家兔制备免疫血清，该免疫血清使山羊痘病毒感染力减少50％的中和指数达到1:123.07。采用纯化的P32蛋白建立了检测山羊痘血清抗体的间接ELISA方法。
　　应用H.E染色法、凋亡试剂盒检测法、流式细胞仪检测法和DNALadder检测法证实GPV能够诱导BHK-21细胞发生凋亡，结果显示，GPV能引起BHK-21细胞凋亡。

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第一章 羊痘研究进展

1 病原学

2 羊痘病的发病概况

3 病毒感染机制

4 发病机理

5 临床症状

6 病理变化

7 羊痘的诊断

8 羊痘的免疫及疫苗

9 防制措施

10 病毒的基因组研究进展

11 羊痘病毒研究的展望

第二章 基因克隆与表达

1 基因的研究历史

2 基因工程

3 基因表达系统

第一部分 山羊痘病毒某些生物学特性及PCR鉴定方法的研究

第三章 山羊痘病毒贵州分离株的某些生物学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 山羊痘病毒 PCR 鉴定方法的建立与应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第五章 山羊痘病毒 TaqMan-MGB 实时定量荧光 PCR 鉴定方法的建立与应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第六章 山羊痘人工感染试验

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

第二部分 P32 基因的研究

第七章 GPV P32 基因的克隆测序及序列分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第八章 GPV P32 基因的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第九章 GPV P32 基因的原核表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第十章 GPV P32 基因的真核表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第十一章 P32 表达蛋白的抗原性分析及间接 ELISA 方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第十二章 山羊痘病毒诱导 BHK-21 细胞凋亡的检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

致谢

参考文献

附录一 发表论文与参见学术会议情况

附录二 主要英文缩写及含义

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