乙脑病毒分离株PrM/E和E基因表达载体构建及E基因表达的研究

摘要

乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV）属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属，是一种由蚊虫传播的急性病毒性传染病，对人类危害巨大。猪是JEV最重要的自然增殖动物，是乙型脑炎的主要传染源，能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎。因此，探讨研究JEV的防制对于人类健康和养猪业具有重要的意义。
　　本试验通过收集某猪场一例发病种公猪的睾丸，处理后经细胞培养和乳鼠脑内接毒等方法分离JEV，采用RT-PCR方法对所分离的病毒进行鉴定，并将扩增的PrM/E基因测序结果与GenBank上强毒株JEVSA14(U14163)和弱毒株SA14-14-2(AF315119)基因序列进行比较，结果表明：乙型脑炎病毒贵州分离株的基因核酸序列与SA14和SA14-14-2的同源性分别为98.1％和97.1％，氨基酸序列同源性分别为99.3％和97.8％，毒力实验和序列分析均显示分离病毒为乙脑病毒强毒株，遗传进化分析表明分离株为基因Ⅲ型。对E蛋白的跨膜结构，亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构分析结果表明：乙型脑炎病毒贵州分离株的E蛋白基因可能在肽链的第146～156、184～190、386～392位等氨基酸区域内或附近存在优势的抗原表位。
　　通过设计2对引物，从分离毒株的细胞培养液中提取总RNA，采用RT-PCR实验技术，分别扩增出PrM/E与E基因片段，并将其分别克隆至pMD19-T载体中，经测序和酶切鉴定后，再将PrM/E和E基因分别克隆于原核表达载体pET32a(+)和真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功构建原核表达质粒pET32a(+)/PrM/E和pET32a(+)/E及真核表达质粒pcDNA3.1(+)/PrM/E和pcDNA3.1(+)/E。
　　将上述构建的原核表达质粒pET32a(+)/E转入E.coliBL21(DE3)中，经IPTG诱导进行表达，并通过Ni-IDA纯化E蛋白，经Western-Blotting分析E融合蛋白有良好的抗原性。分别分纯化后的E蛋白与完全弗式佐剂、不完全弗式佐剂混合及不使用佐剂三种免疫小鼠，结果显示E蛋白加入佐剂后比单独使用更能刺激机体产生较好的免疫效果。

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第一章 乙型脑炎病毒贵州株的分离与鉴定及E基因生物信息学分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二章 乙型脑炎病毒贵州分离株 PrM/E 和 E 基因克隆及表达载体的构建

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

第三章 E基因的原核表达及其免疫原性的研究

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

文献综述

参考文献

附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文

附录二 本文用到的部分英文缩写及含义说明

致谢

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