果梅果实有机酸组分及代谢研究

摘要

本研究以贵州特色果树资源果梅（Prunus mume Sieb. et Zucc）为材料，对果实发育过程中有机酸含量、相关代谢酶活性、柠檬酸代谢关键酶基因的调控等进行了研究。探讨果实发育过程中有机酸的积累规律及差异，明确有机酸积累的关键时期及其关键酶，为果梅果实有机酸积累、代谢和调控研究提供理论基础。取得的主要结果如下：
　　1.采用Shim-pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)，色谱条件为：流动相A：0.1％HPO4，流动相B：3%CH3OH；总流速0.5 ml/min；检测波长210 nm；柱温25℃；在此条件下，7种有机酸都得到很好分离。各有机酸的线性相关系数R2大于0.9992，精密度检测RSD为0.26%～1.75%；回收率在85.8%～105.4%。表明该方法简单快捷、准确、重复性好、可用于果实中有机酸的测定。
　　2.在单因素试验基础上，以提取温度、时间、料液比、超声波频率为自变量，有机酸提取量为响应值，使用中心组合（Box-Behnken）试验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法，依据回归分析法对各个因素的显著性和交互作用进行分析。结果表明，果实有机酸的最佳提取工艺为超声温度36℃、超声时间30 min、液料比19:1 mL/g、超声频率59 kHz、提取次数2次。在此条件下有机酸提取量的预测值为6.40%，实测值为6.24%，两者较接近。这表明Box-Behnken试验设计和响应面分析法，可以最佳地优化果梅果实有机酸的超声辅助提取工艺。
　　3.利用高效液相色谱法（HPLC）对8份果梅单株的不同器官中有机酸含量和果实发育过程中主要有机酸组分的变化进行了研究。结果表明，不同器官中有机酸组分和含量差异较大，果肉中主要含有柠檬酸、苹果酸等7种有机酸组分，其中柠檬酸含量最多，占总酸的73.20%；果皮也以柠檬酸、苹果酸为主；花器官中主要含有苹果酸和乳酸，分别占总酸的33.46%和33.48%；种子中乳酸含量最高，占总酸的比例为35.29%；叶片中以草酸为主。
　　果实发育过程中可滴定酸、柠檬酸含量呈增加态势，苹果酸、草酸、乳酸组分均不同程度表现出先升高后降低的趋势，而酒石酸、乙酸和琥珀酸组分均表现出下降的趋势。果实中柠檬酸在花后45 d含量较低且变化趋势较为平缓，至花后70 d，柠檬酸含量急剧上升，到成熟时达到最高值，高低顺序分别为‘荔波-11’＞‘荔波-3’＞‘荔波-5’＞‘荔波-7’＞‘荔波-1’＞‘荔波-9’＞‘荔波-8’＞‘荔波-12’。苹果酸、草酸、乳酸组分在花后100 d左右含量最高，后随着果实的发育不断下降。酒石酸、乙酸和琥珀酸组分在幼果期含量相对较高，成熟时含量较低。
　　4.为了探明单个果实有机酸积累的关键时期，以‘荔波-3’和‘荔波-11’两个单株为试材，分析不同发育阶段单个果实有机酸积累量的变化。结果表明，单个果实中以柠檬酸积累为主，分别占单果酸含量的71.23%和76.14%，其次为苹果酸，分别占单果酸含量24.34%和15.41%；花后140 d柠檬酸积累量达到最大，单个果实中总酸的积累量也相应的达到最大值。
　　5.以‘荔波-3’和‘荔波-11’单株为材料，测定果实中柠檬酸和苹果酸相关代谢酶活性，结果表明，果实发育前期柠檬酸合酶（CS）活性较低，细胞质乌头酸酶（Cyt-ACO）活性和异柠檬酸脱氢酶（NAD-IDH）活性相对较高，柠檬酸积累较少，果实发育后期CS活性上升，促进了柠檬酸的大量积累，果实成熟时Cyt-ACO活性和 NAD-IDH活性下降，柠檬酸含量达到最大值；果实发育前期 NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性较高，NADP-苹果酸酶（NADP-ME）活性相对较低，使苹果酸积累不断增加，果实成熟前NADP-ME突然升高，而NAD-MDH活性和PEPC活性不断降低，使苹果酸的积累量下降。经相关性分析表明：苹果酸含量与NADP-ME活性呈负相关性，与NAD-MDH、PEPC呈极显著、显著正相关性，而两者的柠檬酸含量均与CS活性呈极显著正相关性。
　　6.采后常温和低温贮藏下果梅果实中有机酸含量均呈下降的趋势；常温和低温条件下，柠檬酸含量都呈下降的趋势，低温下降的趋势缓于常温贮藏，低温有利于减少柠檬酸的消耗；苹果酸含在整个发育过程中呈“波浪式”不断下降。
　　7.果梅CS和IDH基因的cDNA全长分别为1542 bp和1140 bp，分别编码513和379个氨基酸残基，分别命名为PmCS（KP739951）和PmIDH（KP739952）。经生物信息学分析，PmCS和PmIDH蛋白均为非跨膜性亲水蛋白，经亚细胞定位预测，这两个基因均定位于线粒体。经荧光定量PCR分析表明，PmCS， PEPC和PmIDH在果梅各组织中均有表达，且均在果肉中表达量最多，种子中最少；同时果梅果实不同发育时期PmCS，PEPC和PmIDH基因表达与相应酶活性的表现是一致的，与对相应的酶表现为正调控的作用，从而调控柠檬酸代谢。

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1 前言

1.1 立题背景

1.2 国内外研究进展

1.3 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验设计

2.3 试验方法

3 结果与分析

3.1 HPLC测定果梅果实有机酸含量方法的优化

3.2 果梅中有机酸的提取工艺研究

3.3 果实生长发育动态

3.4 果实中有机酸含量的动态变化

3.5果梅果实有机酸组分在单个果实中积累动态

3.6 有机酸代谢相关酶活性变化

3.7 不同贮藏温度下果梅果实中有机酸组分的变化

3.8柠檬酸合酶代谢关键酶基因相对表达分析

4讨论

4.1果实中有机酸组分的特点

4.2苹果酸与相关代谢酶的关系

4.3柠檬酸与相关代谢酶的关系

4.3柠檬酸积累与柠檬酸代谢的基因调控

5 结论

致谢

参考文献

附录

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