PKC抑制剂SP及激活剂PMA影响DEV增殖研究

摘要

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)，是阻碍养鸭业健康发展的重要病原之一。实验室前期研究发现了 DEV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)及其宿主细胞受体即蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor，PKCI)。PKCI是宿主细胞内蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)的抑制蛋白质， PKC是宿主细胞磷酸化通路的关键分子，参与多种病毒的增殖过程。但宿主细胞磷酸化通路是否影响DEV侵染过程，尚无文献报道。为此，本研究利用PKC经典抑制剂(Staurosporine，SP)和专性激活剂(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)开展磷酸化通路在DEV感染中的作用研究，以期为阐明DEV侵染机理提供一些新的线索和思路。
　　1．鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立：根据GenBank上PKC基因设计和合成特异性引物，通过PCR扩增从鸭胚成纤维(DEF)细胞mRNA提取样本中获取目的基因片段，构建重组质粒GV pXT19-T-PKC，并以其为阳性标准品建立荧光定量PCR检测方法和标准曲线，然后进行重复性、特异性和敏感性验证，结果显示：荧光定量PCR标准曲线的线性关系为Y=-3.3340x+44.199，相关系数为0.9954，扩增效率为99.19％；熔解曲线仅出现单特异峰，对H5亚型AIV、H7亚型AIV、H9亚型AIV、NDV和DHV均未检测到荧光信号。这表明本试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏性。
　　2．SP和PMA对DEV毒力的影响：取DEV贵州强毒株，接种DEF细胞，测定TCID50值；取培养成单层的DEF细胞，分别用SP和PMA(浓度均为100nmol/L)处理4h，分别加入系列稀释的DEV进行孵育，观察和测定TCID50值变化；分别以不同浓度的SP和PMA处理DEF细胞后，再加入0.01MOI的DEV进行孵育，观察和分析病毒TCID50值变化，结果：DEV贵州强毒株的TCID50值为3.16×10-9/0.1mL；经SP处理，随处理浓度的加大，病毒TCID50值随之下降，但浓度到100nmol/L时，病毒TCID50值回升；经PMA处理，在20至50nmol/L时病毒TCID50值随之上升，但到100至200nmol/L时，病毒TCID50值反而下降。这表明经SP和PMA处理，可影响DEV毒力即DEV的增殖。
　　3．SP和PMA对PKC、PKCI和DEV-NP基因转录的影响：取培养成单层的DEF细胞，经SP和PMA处理后，再用DEV感染，然后收集细胞培养物，应用前期建立的荧光定量PCR方法检测分析PKC、PKCI和DEV-NP基因的转录水平，结果：SP处理组PKC、PKCI和DEV-NP基因的转录水平分别为2.62×109 copies/μL、2.61×102 copies/μL和6.65×100 copies/μL；PMA处理组相应为3.92×108 copies/μL、5.24×101 copies/μL和2.55×108 copies/μL；病毒对照组相应为8.11×106 copies/μL、5.83×101 copies/μL和2.74×102 copies/μL。这表明，SP处理能降低DEV增殖水平，而PMA处理能提高DEV增殖水平。

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缩略词

文献综述一:鸭病毒性肠炎研究概况

文献综述二:PKC和PKCI研究概况

第一章 鸭源PKC基因荧光定量PCR检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 SP和PMA对DEV毒力和增殖的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 SP和PMA对PKC、PKCI和DEV-NP基因转录的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

全文结论

参考文献

附录一 攻读硕士学位期间发表论文情况

附录二 攻读硕士学位期间参与的主要科研项目

附录三 各种溶液、试剂和培养基的配制

致谢

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