用光学原子磁力仪在超低场下研究核酸适配体与凝血酶间的相互作用

摘要

核酸与蛋白质作为生命体系中最为重要的两类物质，在各种生理代谢活动中扮演着重要的角色。核酸是生物体内储存遗传信息的主要载体,蛋白质是构成各种生命体的基石。生物体中各种功能和代谢活动都是由生物体内DNA与蛋白质或其它生物分子之间相互接触，然后引发各种反应而引起的。如信号的传递、异物的识别、核酸的复制、转录和翻译等都离不开它们之间的相互接触。研究生物体内这些生物大分子之间的相互作用对我们解释各种生理现象，进行疾病诊断和药物治疗具有十分重要的意义。目前，针对如何获得核酸与蛋白之间精确的相互作用的力，仍然是当前研究领域的热点和难点问题。尽管一些单分子力谱技术如AFM、磁镊、光镊等在生物分子间相互作用的研究上取得了很大的进步，但它们的力谱分辨率仍有待进一步提高。同时如何快速、高效的对它们之间的相互作用模式进行多方面、多角度的测量仍然充满挑战。
　　本论文首先对不同力谱技术在研究生物分子间相互作用这个新兴领域做了一个综述。然后以凝血酶蛋白及其核酸适配体（apt15）为研究对象，拟重点采用一种全新的超低场力谱技术，在超低磁场中以磁性粒子为分子探针，通过直接法和间接法两种方案，从束缚状态到自由状态对它们之间的相互作用力进行精确测量。通过不同的实验设计方案，综合考察了凝血酶蛋白与其核酸适配体的相互作用方式和结合能力。
　　论文主要研究工作如下：
　　第一章，对核酸适配体与凝血酶蛋白之间相互作用的研究情况进行了概述。然后主要介绍了目前研究核酸与蛋白质相互作用的一系列单分子操作技术，如原子力显微镜（AFM）、光镊和磁镊以及它们各自在研究领域的应用范围和最新研究进展。最后重点介绍了最近开发的一种全新的超低场生物力谱技术---光学原子磁力仪，简单回顾了目前它在双链DNA解离、细胞成像、药物筛选等方面的重要应用。
　　第二章，基于超低场生物力谱技术，研究了自由状态下凝血酶蛋白与核酸适配体之间的相互作用。通过设计一系列不同序列长度的互补DNA分子，控制核酸适配体与互补DNA形成双螺旋结构，从而调节核酸适配体与凝血酶的相互作用。研究凝血酶蛋白在没有任何束缚，即自由存在的情况下，不同序列结构双链DNA之间力谱的变化情况。采用超低场力谱技术，通过高精密的离心装置产生微扰力，获得DNA的解离力谱图。间接计算出自由状态下的凝血酶蛋白与其核酸适配体之间的相互作用力大小约为69±4pN。
　　第三章，研究了固定状态下的凝血酶蛋白与核酸适配体之间的相互作用情况。在不引入与核酸适配体互补的单链DNA链情况下，将凝血酶蛋白固定在修饰好的基底表面，然后加入核酸适配体与固定状态的下的凝血酶蛋白反应。施加微扰力直接使它们解离，测得核酸适配体与凝血酶之间解离力的大小为80pN。然后通过改变作用的时间和大小，获得了它们之间解离动力学信息，深入讨论了核酸适配体和凝血酶蛋白结合的分子机制及其对解离过程的影响。同时与上一步的研究结果进行了对比分析。
　　第四章，探索固定状态下凝血酶与核酸适配体反应之后，再加入不同长度的互补DNA序列，观察互补DNA链对它们之间相互作用的影响。通过分子调控的机制，改变核酸适配体与凝血酶蛋白相互作用的强弱，进而调控互补 DNA、核酸适配体、凝血酶蛋白三者之间的竞争交换反应强弱。通过测定双链DNA之间的解离力间接获得固定状态下核酸适配体与凝血酶蛋白之间的相互作用力大小。与前面两种方法的研究结果进行对比分析。发现固定状态下的凝血酶蛋白与核酸适配体之间的相互作用强于自由状态下它们之间的相互作用。

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第一章 绪论

1.1核酸适配体与凝血酶蛋白相互作用研究进展

1.2力谱技术概述

1.3 超低场生物力谱技术

1.4 本论文的研究思路

第二章 自由状态下凝血酶蛋白与核酸适配体之间的相互作用

2.1引言

2.2实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 直接法研究固定状态下的凝血酶蛋白与核酸适配体（T15）之间的相互作用

3.1 引言

3.2实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 互补DNA对固定状态下凝血酶与核酸适配体相互作用的调控作用

4.1引言

4.2实验部分

4.3结果与讨论

4.4 本章小节

第五章 总结和展望

参考文献

致谢

附录