贵州省畜禽主要病原菌耐药性及耐药基因研究

摘要

随着我国畜禽集约化养殖的不断发展，畜禽病原菌的耐药性问题日益突出。由于抗菌药物的不合理使用，使得耐药菌株不断涌现，多重耐药现象不断恶化，耐药机制愈加复杂，这给畜禽细菌病临床治疗带来了很大的困难，严重威胁着公共卫生安全，也给新药开发带来了巨大的压力。贵州省有关畜禽细菌耐药性系统研究鲜有报道，本研究拟在分析研究资料和调查报告的基础上，开展贵州省畜禽主要病原细菌的快速检测技术、耐药表型和基因型、耐药基因序列进化特征等相关研究，对深入探讨细菌耐药性分子机制具有理论意义。
　　1.贵州省畜禽源主要病原细菌流行病学研究：通过对贵州省2008~2014年间研究资料、调查报告进行统计分析，分别从时间分布、动物类别分布、地域分布等方面对畜禽养殖场细菌性疫病流行特点进行分析，并对畜禽细菌病临床病例的防控情况进行调查分析。结果显示：此间贵州省畜禽细菌性疫病主要以大肠埃希氏菌病、葡萄球菌病、链球菌病、巴氏杆菌病和沙门氏菌病为主；发病呈一定的季节性，每年5~9月为高发期，10~12月为低发期，细菌性疫病发生主要以羊为主，其余依次是猪、牛、禽等；各地细菌病发病例数存在一定差异，其中铜仁市各种主要细菌性疫病的病例数高于其他地区，细菌性疫病免疫防控率较低，免疫率在2.3％~20.6%之间，主要防控方式依然是抗菌药防控。养殖场最常用的抗菌药物有β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、大环内脂类和喹诺酮类抗菌药物，其中β-内酰胺类使用最为频繁。
　　2.畜禽主要病原菌多重PCR方法的建立与应用：针对贵州省主要流行病原菌（大肠埃希氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌实验室前期分离，进行过相关致病性研究）设计合成引物，构建PCR反应体系和反应条件，并评估多重PCR方法的性能，对研究所需的分离菌株进行复检分析。结果显示：所设计的各种细菌PCR引物均能有效扩增目的基因，其中扩增出的大肠埃希菌23S rRNA基因、巴氏杆菌KMT基因、沙门氏菌invA基因、葡萄球菌的nuc基因和链球菌的EF-TU基因片段大小分别为663 bp、456 bp、284 bp、500 bp和197 bp。构建能同时检测葡萄球菌和链球菌的双重PCR最佳反应条件为：葡萄球菌和链球菌的引物浓度分别为0.5μmol/L和0.5μmol/L，退火温度为54℃；在此条件下同时检测葡萄球菌和链球菌的敏感性分别是1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。构建能同时检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌和巴氏杆菌的三重PCR最佳反应条件为：大肠埃希氏菌、巴氏杆菌和沙门氏菌的引物浓度分别为1.0μmol/L、1.5μmol/L和1.0μmol/L，退火温度为56℃；在此条件下同时检测大肠埃希氏菌、巴氏杆菌和沙门氏菌的敏感性分别是114.00 pg/μL、1.50 ng/μL和1.44 ng/μL。对147株临床分离菌株的检测显示，双重PCR和三重PCR检测结果与生化鉴定结果的符合率分别为97.26%和98.72%，结果表明所建立的PCR方法检测结果跟传统生化鉴定结果高度一致。
　　3.畜禽主要病原细菌耐药表型和耐药基因型研究：随机选取畜禽5种病原菌共151株，应用K-B法对5类21种抗菌药对其进行药物敏感性实验，并针对β-内酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、大环内脂类耐药基因、链霉素耐药基因和磺胺类耐药基因设计合成了23对特异性引物，检测各种细菌耐药相关基因，分析细菌耐药表型和耐药基因型相关性。结果显示：所有供试菌株均表现出明显的耐药性，总耐药率在54.42%~93.20%之间，多重耐药主要集中耐6-11种药物之间。在选取的21种抗生素中，以青霉素、阿莫西林、链霉素和磺胺甲基异恶唑的抑菌效果较差；23个耐药基因共检出19个，检出率最高的是大肠埃希氏菌喹诺酮类aac(6’)-Ib-cr，为77.59%。介导我省大肠埃希氏菌对磺胺类药物产生耐药性的耐药基因主要是sul1、对喹诺酮类药物产生耐药性的耐药基因主要是aac(6’)-Ib-cr，对β-内酰胺类药物产生耐药性的耐药基因主要是TEM；介导我省巴氏杆菌对磺胺类药物产生耐药性的耐药基因主要是sul2、对链霉素产生耐药性的耐药基因主要是StrA；介导我省沙门氏菌对磺胺类药物产生耐药性的耐药基因主要是sul2、对链霉素产生耐药性的耐药基因主要是StrA；介导我省葡萄球菌对大环类脂类药物产生耐药性的耐药基因主要是ermB，对β-内酰胺类药物产生耐药性的耐药基因主要是blaZ；介导我省链球菌对大环类脂类药物产生耐药性的耐药基因主要是ermB；通过对151株临床分离株耐药表型和耐药基因相关性分析，结果显示：细菌对链霉素耐药的耐药基因跟耐药表型的符合率最高，为100%，巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药表型与耐药基因型的符合率最低，为71.43%。
　　4.畜禽主要病原细菌耐药相关基因序列分析：应用分子克隆技术对各种细菌主要耐药基因进行克隆及测序，应用MegAlign软件对测序序列进行同源性、基因一致性和遗传进化分析。结果显示：除大肠埃希氏菌aac(6’)-Ib-cr基因、巴氏杆菌gyrA和parC基因、链球菌gyrA和parC基因存在较多变异外，其他耐药基因均表现出较高的保守性，其中最保守的是大肠杆菌CTX-M基因、巴氏杆菌sul2基因和链球菌mefA基因，与国内外参考菌株的序列同源性均为100%。
　　结论：
　　1.贵州省畜禽细菌病主要病原菌为大肠埃希氏菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌；细菌病发生存在时间和地域差异。
　　2.建立可快速鉴定大肠埃希氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的三重PCR方法和葡萄球菌、链球菌的双重PCR方法，二者对临床分离株的检测结果与生化试验鉴定结果符合率高。
　　3.贵州省畜禽五种主要病原细菌存在广泛耐药，耐药基因种类多样，耐药表型和耐药基因型高度统一。
　　4.贵州省畜禽五种主要病原细菌耐药基因相对保守，部分耐药基因存在点突变。