火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子序列克隆及表达分析

摘要

反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子，具有多拷贝、插入位点多态、高度异质等特性。反转录酶（Reverse transcriptase，RT）是长末端重复反转录转座子中具有转录活性的部分，其序列克隆和分析对深入研究反转录转座子在植物基因组进化、遗传变异和相关性状形成等方面具有重要价值。火龙果芽变资源丰富，目前生产上火龙果主栽品种多为芽变品种，芽变品种源于体细胞变异。体细胞变异的机理涉及多个方面，而反转录转座子激活被认为是导致植物体细胞变异的重要原因。
　　本文以火龙果红皮红肉品种‘新红龙’及其芽变品种‘紫红龙’、红皮白肉品种‘白玉龙’及其离体突变体为试验材料，通过用简并引物扩增方式克隆火龙果基因组Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶DNA序列；利用半定量RT-PCR检测Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶的转录活性，及其在外源激素和逆境处理中的表达情况。主要研究结果如下：
　　1）将PCR特征片段（约430 bp）回收纯化、克隆及测序，经Blast比对，去除重复与过短序列，共获得82条Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶DNA序列，命名为HURT1~HURT86。其中31条RT序列来自红肉品种‘新红龙’及其芽变类型‘紫红龙’，51条来自白肉品种‘白玉龙’及其离体突变体。GenBank的登录号分别为KU977005~KU977006，KU977008~KU977029，KU97-7031~KU977050，KU977052~KU977063，KU977065~KU977089和KX090146。
　　2）生物信息学分析显示，红肉和白肉火龙果RT核苷酸序列间的相似性分别为36.75%~98.39%和33.63%~99.31%；绝大部分RT序列富含碱基AT，AT所占比例范围为48.6%~63.0%。克隆的82条序列无内含子，将其翻译成氨基酸，对比Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶基因的氨基酸保守序列，发现有55条序列发生终止密码子突变，5条序列发生移码突变。系统进化分析结果表明，火龙果RT与水稻、拟南芥有较高的同源性。
　　3）转录活性检测表明，所有RT序列在田间正常生长植株上无转录活性，仅有3条RT序列（HURT1、HURT56和HURT70）在组培条件下有转录活性，并且它们在组培、逆境及激素处理中差异表达。
　　4）为进一步探讨火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子的结构和功能，利用染色体步移法通过两步巢式PCR扩增，成功获得其3’端序列RT-RNaseH，命名为REHu1，序列长度为1,293 bp。

目录

缩略词表

第一章 前言

1.1植物反转录转座子研究进展

1.2火龙果的体细胞变异与分子鉴定

1.3研究目的与意义

1.4研究内容与技术路线

第二章 火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子序列克隆

2.1试验材料

2.2 实验试剂及仪器设备

2.3 方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第三章 火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子的活性检测

3.1 试验材料

3.2 实验试剂及仪器设备

3.3 试验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

第四章 火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子LTR序列克隆

4.1 试验材料

4.2 实验试剂及仪器设备

4.3试验方法

4.4 结果与分析

第五章 总结与展望

5.1 主要结果

5.2 后续工作展望

参考文献

致谢

附录

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