GluN对笼养蛋鸡产蛋后期骨骼和钙代谢的调节机理研究

摘要

课题组前期研究显示氨基葡萄糖（GluN）有调控骨骼代谢的作用，但其调控机制尚不清楚。鉴此，通过考察GluN对笼养蛋鸡后期产蛋性能、蛋品质、蛋壳品质、骨质性状、消化代谢和骨骼相关基因表达的影响，以探讨 GluN 对蛋鸡的调控机理，为 GluN在蛋鸡饲粮中的合理应用提供理论依据。研究分为3部分： 试验一：GluN对蛋鸡产蛋后期产蛋性能、蛋品质、骨质性状和血清生化指标的影响。采用单因素试验设计，将产蛋率相近（70%）的512只蛋鸡分为4组，每组8个重复，每个重复16只鸡，每组试鸡分别采食添加0%、0.4%、0.6%、0.8%GluN的饲粮。预饲期15 d，正试期60 d。结果表明：（1）饲粮中添加GluN可提高产蛋率、促进蛋鸡采食和降低异常蛋率。其中，0.4%GLuN组蛋鸡产蛋率比0%组提高5.87%（P<0.1）；0.6%GLuN组全期采食量比0%组提高8.33%（P<0.1）；0.6%GLuN组异常蛋率比0%组降低30.22%（P<0.1）。随着试验期的延长，0.6%GluN组正面效应更明显。（2）GluN有提高蛋壳重量、蛋壳强度和蛋壳钙质量的作用。试验30d和60d时，添加GluN后有提高蛋壳重量和蛋壳强度的趋势（P<0.1）；试验30d时，0.4%GluN组蛋壳钙质量显著高于0.6%GluN组（P<0.05），试验60d时，0.6%GluN组蛋壳钙质量显著高于0.4%GluN组（P<0.05）。（3）随着试验期的延长，相比 0%和 0.4%GluN 组胫骨骨密度的逐渐降低，0.6%GluN和0.8%GluN组则分别提高了44.74%、44.79%，而股骨骨密度和肱骨骨密度一直呈下降趋势，但0.6%GluN和0.8%GluN组的下降趋势明显低于0%和0.4%GluN组；试验60d时，0.6%GluN 组显著提高了股骨的杨氏模量、最大载荷和最大弯曲应力（P<0.05），分别比0%组提高64.5%、20.47%和59.5%；60d时，GluN显著提高了胫骨皮质骨厚度、骨面积和胫骨皮质骨面积百分率（P<0.05），相比0%组，0.6%GluN组胫骨皮质骨厚度、骨面积和面积百分率分别提高了 36.8%、37.0%、17.12%；通过对比骨切片 HE 染色结果发现，30d时，0.6%GluN组骨小梁连续性较好；60d时，0.8%GluN组骨小梁连续性较好。（4）30d时，GluN显著促进了血清中CT、E2和Ca含量（P<0.05），同时显著降低了 IL-6 含量（P<0.05）；60d 时，0.6%GluN组PTH显著高于对照组，0.6%GluN 组E2含量显著高于对照组（P<0.05），此外，GluN有提高血清Ca含量和降低IL-6、PGE2含量的趋势（P<0.1）。 试验二：GluN 对蛋鸡饲粮钙吸收的调节。试验用差量法探究 GluN 对饲粮钙吸收的影响。采用2×3水平的因子设计，将36只产蛋后期健康的海兰灰蛋鸡随机分成2个处理组，第一组为0%GluN组，另一组为GluN组，每个处理组各设置3个钙水平组，分别为3.0%、3.2%和3.4%，共6个小组。每个小组3个重复，每个重复2只蛋鸡。试验组饲粮在0%GluN组的基础饲粮中分别添加0.6%GluN。预饲期为4d，试验期为3d。全收粪法收集排泄物并制成风干样品，测定饲粮和排泄物中钙含量，计算钙表观代谢率后，验证内源钙排泄量的稳定性，差量计算出钙真代谢率。待代谢试验结束后，采集小肠样本，采用RT-PCR（实时荧光定量PCR）分析小肠钙结合蛋白-28k（Cabp-D28k）基因表达。结果显示：对照各组饲粮Ca表观代谢率在49.62%~52.76%之间（P>0.05），GluN各组则在62.49%~65.66%（P>0.05），数据分析表明钙水平对两组饲粮钙表观代谢率均无显著影响（P>0.05），但添加GluN显著提高了饲粮钙的表观代谢率12.89%(P<0.05)。试验表明，饲粮钙水平和GluN水平对钙的内源排泄量均无显著影响P>0.05），各组钙内源排泄量平均为每千克干物质采食量的 0.61g。添加 GluN 极显著促进了钙的吸收， GluN 饲粮钙真代谢率为 81.79%，与 0%GluN 组相比，提高了 11.2%(P<0.01)。同时， GluN能显著上调十二指肠中Cabp-D28k基因的表达。因此，GluN对机体小肠钙的吸收可通过提高十二指肠中Cabp-D28k基因表达而得以实现。 试验三：GluN对骨骼组织中OPG、RANK、RANKL、CTK、CTR以及IL-6基因表达的影响。试验设计同试验一。于试验30d、60d，从各试验组中分别挑选体重相近试鸡5只，取左胫骨，提取 RNA，用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法考察GluN对骨代谢相关基因OPG、RANK、RANKL、IL-6、蛋白组织酶K（CTK）和降钙素受体（CTR）基因表达的影响。结果表明：（1）GluN上调OPG基因表达，下调RANK和RANKL基因表达，同时降低RANKL/OPG；（2）60d，GluN下调IL-6基因表达（P<0.05）；（3）整个试验期，GluN显著降低了0.6%GluN组CTK基因的表达（P<0.05）；（4）整个试验期，相比0%组而言，0.6%GluN组提高了CTR基因的表达。 得到以下结论： （1）添加GluN提高了蛋鸡日均采食量、产蛋率、蛋壳重量和强度，降低异常蛋率，且随作用时间延长，效应越明显； （2）GluN通过上调蛋鸡肠道中Cabp-D28k基因表达，促进钙的吸收； （3）GluN 提高了血钙浓度，促进E2，CT分泌，抑制PHT、IL-6和PGE2分泌，； （4）GluN上调OPG和CTR基因表达，抑制CTK和IL-6基因表达； （5）GluN增加骨小梁连续性，增加骨密度、骨强度和骨厚度； （6）GluN的作用途径：GluN通过提高蛋鸡肠道中Cabp-D28k基因的表达量，促进钙的吸收，一方面提高了蛋壳钙含量，另一方面提高血钙浓度，反馈性地促进 E2、CT分泌，抑制PTH分泌，进而上调蛋鸡胫骨中OPG和CTR基因表达，下调RANKL、CTK和IL-6基因表达，降低RANKL/OPG比值，从而减少破骨细胞的活性以及骨基质降解，同时抑制炎症因子IL-6和PGE2分泌，因而减少机体炎症效应，最终增强骨小梁连续性，增加骨密度、骨强度和骨厚度。本试验条件下GluN的适宜添加水平是0.6%。

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