烟草甲4个clip丝氨酸蛋白酶基因的鉴定及生理功能分析

摘要

作为激活胞外级联通路的重要组成部分，clip丝氨酸蛋白酶基因（clip-domain serine proteases,CLIPs）在昆虫变态发育和免疫生理过程中发挥着重要作用。本研究以重要仓储害虫烟草甲Lasioderma serricorne为研究对象，基于烟草甲转录组数据库克隆4个CLIPs基因（LsCLIP1、LsCLIP2、LsCLIP3和LsCLIP4），探讨其在烟草甲幼虫化蛹、先天免疫中的功能，对筛选有效的靶标来防治烟草甲具有重要意义。 1.烟草甲LsCLIPs基因的克隆及序列分析 利用RT-PCR技术克隆了烟草甲4个LsCLIPs基因，包括LsCLIP1、LsCLIP2、LsCLIP3和LsCLIP4的开放阅读框（open reading frames,ORFs），其ORFs长度分别是1194bp，1194bp，1173bp和1158bp，分别编码397，397，390和385个氨基酸，相对分子质量分别为44.3，43.4，43.0和42.3kDa，等电点分别是6.18，5.19，5.85和6.10。通过SMART在线软件分析表明，4个LsCLIPs基因编码的氨基酸序列在N端分别含有起调控作用的clip结构域，每个clip结构域含有6个保守的半胱氨酸残基，形成3对二硫键，同时C端是一个典型的丝氨酸蛋白酶保守结构域（trypsin-like serine protease domain,Tryp_SPc domain），即含有TAAHC、DIAL和GDSGG三个保守的序列。运用软件DNAMAN6.03将这4个LsCLIPs氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta，赤拟谷盗Tribolium castaneum和冈比亚按蚊Anopheles gambiae进行多序列比对分析，结果表明烟草甲的4个LsCLIPs基因编码的氨基酸序列与上述物种的CLIPs基因编码的氨基酸序列有较高的同源性。运用软件MEGA的邻接法（neighbor-joining,N-J）进行聚类分析研究表明，LsCLIP1和LsCLIP2归属于subfamily C，LsCLIP3归属于subfamily B，LsCLIP4归属于subfamily D。 2.烟草甲LsCLIPs基因的时空表达和20E调控模式 采用qPCR技术解析烟草甲LsCLIPs基因的时空表达与外源激素20E调控模式。结果表明，不同LsCLIPs基因在不同发育阶段和不同组织部位的表达存在一定的差异，20E可诱导LsCLIPs基因高表达。其中，4个LsCLIPs基因在烟草甲各发育阶段均有表达，LsCLIP1和LsCLIP2在蛹期表达量最高，高龄成虫中表达量最低；LsCLIP3和LsCLIP4在低龄成虫中表达量最高，高龄成虫中表达量最低；不同组织部位表达模式解析表明，4个LsCLIPs基因在表皮中的表达量最高，其次是脂肪体和剩余组织，在肠道中的表达量最低。 20E注射烟草甲4龄幼虫后，LsCLIPs基因的相对表达量较对照均升高，且在8h表达量达到最高，mRNA表达量分别为对照的13.68，43.51，79.75和2.33倍，说明20E对4个LsCLIPs基因的表达具有诱导作用。 3.象虫金小蜂寄生和肽聚糖胁迫对烟草甲LsCLIPs基因表达的影响 运用qPCR技术解析象虫金小蜂Anisopteromalus calandrae寄生和肽聚糖胁迫后烟草甲LsCLIPs基因的表达变化。象虫金小蜂A.calandrae寄生烟草甲幼虫或蛹后，LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3基因表达量显著升高，而LsCLIP4表达量与对照相比无明显差异。 对烟草甲4龄幼虫分别以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的肽聚糖（PGN-EB和PGN-SA）进行免疫胁迫，进一步分析烟草甲体内4个LsCLIPs基因mRNA表达变化，结果表明：2种肽聚糖处理后，LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3的相对表达量在不同时间点均出现明显的升高，而LsCLIP4较对照无显著变化。 4.基于RNA干扰的烟草甲LsCLIPs基因生理功能分析 采用烟草甲5龄幼虫为试验材料，利用RNAi技术进一步对LsCLIPs基因的功能进行研究。结果表明，与注射dsGFP相比，分别注射4个LsCLIPs基因的dsRNA后，目的基因的表达量均显著降低，并出现存活率下降的现象，其中试虫致死表型大致可分为两大类：第一类是幼虫虫体局部黑化并呈现不正常的色素沉积；第二类是幼虫虫体全黑化，且虫体严重畸形。LsCLIPs基因表达的下降导致大部分试虫出现蜕皮困难而死亡。研究结果说明4个LsCLIPs基因对烟草甲的蜕皮、变态和发育具有重要作用。 RNAi结合大肠杆菌生物测定，选择RNAi沉默120h（显著抑制）进行大肠杆菌注射，发现RNAi处理组（dsLsCLIP1、dsLsCLIP2和dsLsCLIP3注射组）与对照组相比，死亡率均显著升高，而dsLsCLIP4注射组较对照无显著变化。研究结果说明LsCLIP1、LsCLIP2和LsCLIP3基因参与烟草甲对大肠杆菌的先天免疫。 综上所述，本研究基于烟草甲转录组数据，克隆获得烟草甲4个LsCLIPs基因全长cDNA序列，采用qPCR技术分析其时空表达模式、外源激素20E处理、象虫金小蜂寄生和肽聚糖（PGN-SA和PGN-EB）免疫胁迫后的表达模式，最终运用RNAi及生物测定技术研究其在烟草甲蜕皮发育和先天免疫过程中的功能。研究结果为烟草甲的防治提供理论依据。

目录

第一章 文献综述

1.1 烟草甲的危害及控制

1.2 昆虫的先天免疫

1.3 丝氨酸蛋白酶的研究进展

1.4 clip丝氨酸蛋白酶

1.4.1 clip丝氨酸蛋白酶的结构

1.4.2 clip丝氨酸蛋白酶的分类

1.4.3 clip丝氨酸蛋白酶的生理功能

1.5 立题依据

第二章 烟草甲LsCLIPs基因的克隆及序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 供试昆虫

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 主要溶液的配制

2.1.5 生物信息学分析工具

2.1.6 烟草甲总RNA的提取

2.1.7 反转录合成第一链cDNA

2.1.8 胶回收

2.1.9 连接

2.1.10 转化

2.1.11 阳性克隆的鉴定

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 烟草甲LsCLIPs基因的时空表达与20E调控模式

3.1 材料与方法

3.1.1 供试昆虫

3.1.2 20E处理

3.1.3 主要试剂

3.1.4 反转录合成第一链cDNA

3.1.5 引物设计

3.1.6 荧光定量PCR

3.2 结果与分析

3.2.1 LsCLIPs不同发育阶段表达模式

3.2.2 LsCLIPs不同组织部位表达模式

3.2.3 20E处理

3.3 讨论

第四章 象虫金小蜂寄生和肽聚糖胁迫对烟草甲LsCLIPs基因的影响

4.1 材料与方法

4.1.1供试昆虫及材料

4.1.2 象虫金小蜂寄生方法

4.1.3 肽聚糖胁迫试验方法

4.1.4 主要试剂

4.1.5 反转录合成第一链cDNA

4.1.6 引物设计

4.1.7 荧光定量PCR

4.2 结果与分析

4.2.1 象虫金小蜂寄生对烟草甲LsCLIPs基因表达的影响

4.2.2 肽聚糖胁迫对烟草甲LsCLIPs基因表达的影响

4.3 讨论

第五章 烟草甲LsCLIPs基因的生理功能分析

5.1 材料与方法

5.1.1 供试昆虫

5.1.2 实验试剂

5.1.3 引物设计

5.1.4 dsRNA合成方法

5.1.5 LsCLIPs沉默后烟草甲对大肠杆菌的敏感性

5.1.6 反转录合成第一链cDNA

5.1.7 荧光定量PCR

5.2 结果与分析

5.2.1 LsCLIP1干扰对烟草甲化蛹的影响

5.2.2 LsCLIP2干扰对烟草甲化蛹的影响

5.2.3 LsCLIP3干扰对烟草甲化蛹的影响

5.2.4 LsCLIP4干扰对烟草甲化蛹的影响

5.2.5 基于RNAi的LsCLIPs基因先天免疫功能分析

5.3 讨论

第六章 总结与展望

6.1 主要研究结果

6.1.1 烟草甲LsCLIPs基因的克隆及序列分析

6.1.2 烟草甲LsCLIPs基因的时空表达和20E调控模式

6.1.3 象虫金小蜂寄生和肽聚糖胁迫对烟草甲LsCLIPs基因表达的影响

6.1.4 烟草甲LsCLIPs的生理功能研究

6.2 论文的创新点

6.3 论文的不足及展望

致谢

参考文献

附录

声明