鸭坦布苏病毒-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的研制

摘要

2010年4月我国南方部分地区暴发了一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的新发传染病，研究表明该病病原隶属于黄病毒科（Flaviviridae），黄病毒属（Flavivirus），即坦布苏病毒。该病自暴发以来迅速蔓延至全国大部分养殖地区，对我国水禽养殖业造成了巨大的经济损失。在临床上，该病常与H9亚型禽流感呈混发或继发感染，因此研制用于防控此两种疫病的疫苗尤为迫切。 本研究为了获得更高滴度的抗原，首先对坦布苏病毒的增殖条件进行了优化，结果表明病毒增殖的最适细胞株为BHK-21-JS株，最佳接毒剂量为0.001MOI、最佳收获时间为感染后60h，为坦布苏疫苗抗原的大规模制备提供了技术保障。 本研究为建立合理的人工感染模型，将相同含量的抗原分别以脑内注射、肌肉注射、皮下注射、静脉注射和口服五种途径感染35日龄樱桃谷肉鸭，每组10只。在攻毒后每天观察临床症状并于第3d、6d、10d测量各组体重进行分析。攻毒后1d、2d、3d、4d、5d采集血样，用蚀斑计数试验检测血液中病毒载量的变化情况。同时于攻毒后第3d随机扑杀各攻毒组与对照组部分试验鸭，取脾脏样品进行组织病理学分析。结果显示各攻毒组均出现明显的感染坦布苏病毒后的临床症状，且以脑内注射组最为严重。各攻毒组体重总体均呈现出明显的下降趋势。血清样本噬斑计数试验结果表明五种攻毒途径均可导致鸭产生明显的病毒血症，其中以肌肉注射组血液中病毒含量最高。病理学分析结果显示各攻毒组均出现不同程度脾脏组织结构破坏及淋巴细胞坏死等现象，对照组未见明显病理变化。并将肌肉注射确定为后续灭活疫苗免疫效果判定的最佳攻毒途径。 为研究不同佐剂对二联灭活疫苗免疫效果的影响，本研究利用卡波姆、白油、铝胶及蜂胶作为佐剂与相同含量的灭活抗原制备成不同佐剂的二联灭活疫苗，免疫24日龄樱桃谷肉鸭，免疫后应用血凝抑制试验和阻断ELISA方法分别测定鸭血清中禽流感病毒和坦布苏病毒的抗体水平，以对比不同佐剂疫苗的免疫效力。同时从抗体水平较高的组别于一免和二次免疫后选取5只进行攻击试验，采集攻毒后第1天和第2天血液样本进行病毒含量检测，评价疫苗的免疫保护效果。结果表明白油佐剂制备的疫苗组免疫效力最好。确定了制备二联灭活疫苗的最佳佐剂为白油佐剂。 为研究不同坦布苏病毒抗原含量对灭活疫苗免疫效果的影响，本研究以0.1mL、0.3mL、0.5mL及1mL四个不同坦布苏病毒含量制备的二联灭活疫苗免疫20日龄樱桃谷肉鸭，每组10只，免疫后每周采集血液样本检测抗体水平，试验结果表明当灭活疫苗免疫剂量为0.5mL时即可以得到理想的免疫后抗体水平。为了完善免疫程序，另将30只20日龄非免疫樱桃谷肉鸭随机分为对照组、单次免疫组与两次免疫组3组，两次疫组于一免3周后进行加强免疫。免疫后定期采集血样分别用血凝抑制试验与阻断ELISA方法检测抗体。试验结果表明二次免疫后禽流感抗体及坦布苏病毒抗体阳性率均可达100%，免疫持续期可达18周以上。由此确定灭活疫苗最小免疫剂量为0.5mL，灭活疫苗采取二次免疫能实现更为持久的免疫保护。

目录

缩略语

前言

文献综述

1 鸭坦布苏病毒

1.1 鸭坦布苏病毒概述

1.2 病原学

1.3 流行病学

1.4 临床症状与病理变化

1.5 验室诊断方法

1.6 坦布苏病毒病疫苗的研制

2 A型禽流感病毒

2.1 A型禽流感病毒概述

2.2 A型流感病毒病原学

2.3 禽流感病毒功能蛋白

2.4 禽流感流行病学

2.5 禽流感临床症状与病理变化

2.6 禽流感的疫苗研制

3 本研究的目的及意义

第一章 鸭坦布苏病毒增殖工艺的研究和抗原制备

1.1 材料

1.1.1 毒株、细胞、试验动物

1.1.2 主要试剂耗材

1.1.3 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 TMUV增殖细胞的筛选

1.2.2 TMUV在细胞上繁殖条件的优化

1.2.3 病毒空斑形成单位的测定

1.2.4 坦布苏病毒液的制备及病毒滴度测定

1.2.5 禽流感病毒尿囊液的制备及ELD50的测定

1.3 结果

1.3.1 适于TMUV抗原制备的细胞系的筛选

1.3.2 病毒增殖条件的优化

1.3.3 病毒在BHK-21细胞上的增殖

1.3.4 坦布苏病毒的增殖

1.3.5 禽流感病毒的增殖

1.4 讨论

第二章 鸭坦布苏病毒病感染模型的建立

2.1 材料

2.1.1 毒株

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 实验动物分组与攻毒

2.2.2 蚀斑试验检测血清中的病毒含量

2.2.3 坦布苏病毒抗体的检测

2.2.4 脾脏组织病理学变化

2.3 结果

2.3.1 攻毒后各组体重变化情况

2.3.2 临床症状及剖检病变

2.3.3 攻毒后鸭血清病毒含量变化及检出率

2.3.4 病理组织学变化

2.4 讨论

第三章 鸭坦布苏病毒病-禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的制备及免疫佐剂筛选

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.2 病毒的灭活及检验

3.2.3 不同佐剂灭活疫苗的制备

3.2.6 疫苗的免疫接种

3.2.7 免疫效果的检测

3.2.8 攻毒保护试验

3.3 结果与分析

3.3.1 灭活效果检测

3.3.2 乳化效果检测

3.3.3 免疫鸭的H9亚型禽流感抗体测定

3.3.4 免疫鸭的坦布苏病毒抗体测定

3.3.5 一免后三周攻毒保护效果

3.3.6 二免后二周攻毒保护效果

3.4 讨论

第四章 鸭坦布苏病毒病-禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗最小免疫剂量确定及免疫持续期测定

4.1 材料

4.1.1 疫苗与试验动物

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 阻断ELISA检测病毒抗体滴度操作方法及结果判定

4.2.2 最小免疫剂量试验动物分组与免疫

4.2.3 免疫持续期试验动物分组与免疫

4.2.4 抗体测定

4.2.5 数据分析与处理

4.3 结果

4.3.1 最小免疫剂量试验组抗体变化情况

4.3.2 免疫持续期试验组抗体变化情况

4.4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

附录

声明