火龙果干旱响应miRNA/isomiR的克隆及靶基因验证

摘要

干旱作为植物生长所面临的逆境之一，被认为是导致作物减产的最主要原因。深度解析植物对干旱环境的响应机制，从而有效选育或创造出耐旱种质是解决农作物抗旱的有效措施。microRNA（miRNA）是一类由18至24个核苷酸组成的非编码RNA，在调控植物生长发育上发挥着重要作用，也参与了植物对非生物胁迫的响应。火龙果（Hylocereus）是原产于热带地区的仙人掌科植物，因其果实风味独特具有较高的营养价值，被南方高热量省份作为重要果树推广。作为仙人掌科植物，火龙果表现出极强的抗旱性。因此，全面认识火龙果响应干旱胁迫的分子调控机制，寻找干旱响应的关键基因，对筛选具有更好耐旱能力的火龙果种质及通过遗传改良提升其他植物的耐旱能力具有重要意义。 前期工作中，本实验室通过抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）的方法对火龙果干旱响应的关键基因进行了挖掘。为解析火龙果在miRNA水平的干旱响应机制，本项目以本省主栽优质品种“紫红龙”（Hylocereus polyrhizus‘Zihonglong’）为试验对象，以肉质茎无性系作为试验材料，通过模拟逆境实验对多种细胞生理学指标进行了测定；结合生物信息学和分子生物学的方法克隆了火龙果miRNA的前体和成熟序并对这些miRNA在植物界中的保守性进行了统计；另分别通过生物信息学预测和RNA末端并行分析（parallel analysis of RNA ends,PARE）对火龙果miRNA的靶基因进行了预测和验证，并对验证到的靶向关系在植物界中的保守性进行了统计，挑选部分PARE验证结果进行了RNA连接酶介导的cDNA5'端快速扩增实验（RNA ligase mediated5’rapid amplification of cDNA end,RLM-5-RACE）；利用茎环反转录定量PCR（reverse transcription-quantification PCR,RT-qPCR）对火龙果miRNA在干旱胁迫下的表达情况进行了定量，构建了火龙果miRNA在干旱胁迫下的表达谱；通过自编实际抽取与汇报语言（Practical Extraction and Reporting Language,PERL）脚本对火龙果miRNA变体（miRNA isoform,isomiR）进行了挖掘、定量及靶基因验证，从isomiR水平讨论了miRNA介导的火龙果干旱响应机制；构建了首个植物isomiR数据库。主要结果如下： 1.测定了火龙果组培苗短期干旱逆境下细胞的生理变化 利用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）模拟干旱胁迫对火龙果组培苗进行了72小时处理，并每隔12小时对材料进行取样。结果表明，随着处理时间的延长，细胞内渗透调节物如可溶性糖（soluble sugar,SS）、可溶性蛋白（soluble protein,SP）、游离脯氨酸（proline,Pro）的含量上升；保护性酶如过氧化氢酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性上升；丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量和相对电导率（relative electrolytic leakage,REC）的百分比上升，而胞内水势（water potential,WP）下降。虽然MDA和REC在试验中随处理时间上升，但均维持在较低的水平展现了火龙果幼苗极强的抗旱性。 2.克隆了36个火龙果miRNA的前体及成熟序列 对火龙果组培材料进行了干旱处理并收集样品用于一个转录组和两个小分子RNA（small RNA）文库的构建和测序，相关测序数据已上传到美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）的序列片段归档数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra,Sequence Read Archive,SRA），登录号为SRR8767412、SRR8767414、SRR8767415。通过生物信息学预测和分子克隆的方法分别鉴定了对应39个miRNA前体的34个和30个成熟序列，其中有6个miRNA成熟序列被两种方法同时获得。利用分子克隆的方法，从火龙果基因组DNA上克隆了39个前体中的36个，涵盖21个已知miRNA家族和3个火龙果特有的miRNA家族。这些miRNA的长度多为21个核苷酸（81.94%），首位碱基多为“U”（44.44%）。保守性分析发现，部分miRNA家族在植物界中展现出了系列特异的（lineage specific）现象，如MIR403家族仅存在于双子叶植物，且相同miRNA家族在植物界展现出了极高的碱基保守性，如少数植物miR162的第8位和第20位存在AG核苷酸多态性。 3.验证了32个miRNA在48个Unigene上的剪切事件 psRNATarget、TargetFinder、GSTAr分别在火龙果Unigene上预测到337、1,064、50,119个miRNA结合位点。对火龙果组培材料进行干旱处理并收集样品用于一个降解组文库的构建和测序，相关测序数据已上传到NCBI的SRA数据库，登录号为SRR8767413。利用自编PERL脚本对降解组数据及miRNA结合位点进行PARE分析，共发现32个miRNA对48个被注释的Unigene上的50结合位点进行了显著性切割（Pvalue≤0.05）。从编码的蛋白类型来看，这些靶基因多为转录因子（45.83%），如squamosa promoter-binding-like protein（SPL）、transcription factor GAMYB（MYB）、auxin response factor（ARF）、NAC domain-containing protein（NAC）、homeobox-leucine zipper protein（HD-ZIP）等。其中11个Unigene上的切割事件被RLM-5-RACE实验验证。对火龙果miRNA靶向关系在植物界中的保守性进行分析发现，多数靶向关系在植物界具有极高的保守性如miR156对SPL的靶向保守于所有参考物种；少数靶向关系仅在个别物种中被发现如miR396对1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase（ACS）的靶向保守于6种参考物种。 4.确定了30个miRNA在干旱胁迫下的差异表达 利用NormFinder、geNorm、BestKeeper三种算法对适宜于火龙果非生物胁迫下RT-qPCR实验的内参基因进行了筛选，找出了最优的内参基因组合thioredoxin-like protein YLS8（YLS8）和40S ribosomal protein（RP40S）。利用茎环反转录的方法对32个被验证到靶基因的火龙果miRNA在干旱处理下的表达进行了定量同时构建了火龙果miRNA在干旱处理下的表达谱。结果发现，30个miRNA在至少一个时间点的表达发生了显著变化，暗示这些miRNA在不同时间点对干旱刺激产生了响应。 5.探索了isomiR在火龙果干旱响应中的作用 通过PERL脚本，以火龙果sRNA数据为材料对火龙果isomiR进行了挖掘和注释，分别获得了395个和2,543个templated和non-templated isomiR。统计显示，在末端位置变化上，templated isomiR中多数变化来自于3’端的延伸或缩短，而non-templated isomiR中未变化类型（NO DRIFT）极大地增加了isomiR的数量。其余non-templated isomiR的变化同样集中在3’端；在核苷酸替换上，主要的类型为单碱基替换（SS），紧接着为3’末端替换（3’terminal variation）；在长度上，发现templated isomiR未表现出明显的长度倾向性，但non-templated isomiR多为与miRNA类似的21nt。通过与克隆得到的sRNA进行比对发现，isomiR中有55个的序列被克隆。此外，本项目发现，火龙果non-tempalted isomiR存在3’端核苷酸poly U化的现象且RT-qPCR实验结果表明3’端poly U化的isomiR在干旱处理下表达均表现出了上调的趋势。为探究isomiR是否存在调节基因表达的能力，假设了功能性isomiR的特征并对符合要求的isomiR进行了靶基因的预测及PARE分析。结果表明，部分isomiR在相同或相邻位置参与了miRNA对靶基因的剪切，另有一部分isomiR发生了靶基因的变化增加了miRNA的靶基因数量。以上结果说明isomiR并非是miRNA成熟过程中的垃圾产物，火龙果isomiR协助miRNA参与了对干旱处理的响应且丰富了miRNA的调节网络。 6.构建了植物isomiR在线数据库 通过检索公共数据库，共找到23种植物在正常生长环境下的677份sRNA高通量测序数据。通过大规模的isomiR挖掘及注释，共从6,167条miRNA前体上挖掘出98,734个植物isomiR序列。其中水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）中的isomiR最多分别为24,503、17,516、13,478、7,584个。利用TargetFinder和psRNATarget两种算法对所有isomiR的靶基因进行了预测。通过结合生物信息学分析及多种前端语言的使用，本项目构建了第一个植物isomiR数据库Plant isomiR Atlas。数据库使用了超文本标记语言5（Hypertext Markup Language5,HTML5）进行可视化，网页前端的动态变化使用了服务器端编程语言（Professional Hypertext Preprocessor,PHP），后台数据的储存使用了结构化查询语言（Structured Query Language,SQL）。Plant isomiR Atlas被架设在一台以Ubuntu为操作系统的16核英特尔至强主机上，访问地址为www.mcr.org.in/isomir。通过文献查阅，本研究共收集到来自16种植物在低温、高温、光照、干旱、水涝、高盐等21种逆境下的433份sRNA高通量测序数据。通过不同的算法，分别发现16,157和2,028个isomiR在逆境下差异表达，其中有1,991个差异表的isomiR被两种算法同时发现。利用psRNATarget对这些isomiR的靶基因进行了预测。通过结合使用生物信息学分析及多种前端语言，构建了第一个植物非生物胁迫响应isomiR数据库Diff isomiRs。数据库使用了HTML5语言进行可视化，网页前端的动态变化使用了PHP语言，后台数据的储存使用了MySQL语言。Diff isomiRs被架设在一台以Ubuntu为操作系统的16核英特尔至强主机上，访问地址为www.mcr.org.in/diffisomirs。 综上所述，本论文首次报道了仙人掌科植物的miRNA/isomiR，且从保守性、靶向关系、干旱处理下的差异表达等方面初步揭示了火龙果在干旱逆境下miRNA/isomiR参与的响应机制。

目录

英文缩略词表

英文缩略词表（续）

植物学名表

植物学名表（续）

第一章 前 言

1.1植物miRNA

1.1.1植物miRNA的起源

1.1.2植物miRNA的生物合成

1.1.3作用方式和分子机理

1.2植物miRNA的研究方法

1.2.1序列的获得

1.2.2 miRNA的鉴定

1.2.3 miRNA定量方法

1.3植物miRNA的靶基因

1.3.1植物miRNA及其靶基因的保守性

1.3.2植物miRNA靶基因的预测

1.3.3 植物miRNA靶基因的验证

1.4植物miRNA与非生物胁迫响应

1.5 RT-qPCR内参基因的选择

1.5.1传统内参基因在非生物胁迫下的不稳定性

1.5.2扩增效率与基线设置在定量实验中的重要性

1.5.3非模式生物内参基因的选择及稳定性评估办法

1.5.4火龙果内参基因现状

第二章 火龙果在干旱逆境下的细胞生理学变化

2.1材料与方法

2.1.1试验材料及处理

2.1.2细胞生理指标的测定

2.2结果与分析

2.2.1干旱逆境对渗透调节物含量的影响

2.2.2干旱逆境对保护酶活性的影响

2.2.3干旱逆境对胞内水势、丙二醛含量和相对电导率的影响

2.2.4干旱逆境对气孔开放率的影响

2.3讨论

第三章 火龙果miRNA的预测及克隆

3.1材料与方法

3.1.1试验材料及处理

3.1.2总RNA和DNA的提取及检测

3.1.3 sRNA的提取及检测

3.1.4 转录组文库的构建及测序

3.1.5 sRNA文库的构建及测序

3.1.6 sRNA的克隆

3.1.7 miRNA前体的克隆

3.1.8 火龙果miRNA保守性分析

3.2结果与分析

3.2.1总RNA和DNA的提取及检测

3.2.2测序数据及组装统计

3.2.3 Unigene开放阅读框架预测

3.2.4 Unigene功能注释

3.2.5 sRNA的克隆

3.2.6 miRNA的注释

3.2.7 miRNA前体的序列及二级结构

3.2.8火龙果miRNA保守性分析

3.3讨论

3.3.1 ShortStack在火龙果miRNA预测上的表现

3.3.2火龙果miRNA的克隆

3.3.3火龙果miRNA家族

3.3.4火龙果miRNA在不同植物中的保守性

第四章 火龙果miRNA靶基因的预测及验证

4.1材料与方法

4.1.1试验材料及处理

4.1.2总RNA的提取及检测

4.1.3 miRNA结合位点的预测

4.1.4降解组文库的构建及测序

4.1.5 miRNA结合位点RLM-5-RACE验证

4.1.6火龙果miRNA靶向关系保守性分析

4.2结果与分析

4.2.1总RNA的提取及检测

4.2.2 miRNA结合位点的预测及PARE验证

4.2.3 miRNA靶基因RLM-5-RACE验证

4.2.4 miRNA结合位点保守性分析

4.3讨论

4.3.1三种算法在miRNA结合位点预测上的表现

4.3.2火龙果miRNA与转录因子

4.3.3火龙果miRNA靶向关系的保守性

第五章 火龙果miRNA对干旱逆境的响应

5.1材料与方法

5.1.1火龙果非生物胁迫下内参基因的筛选

5.1.2茎环法定量火龙果miRNA

5.2结果与分析

5.2.1火龙果非生物胁迫下内参基因的筛选

5.2.2茎环法定量火龙果miRNA

5.3讨论

5.3.1 看家基因作为内参基因的不稳定性及对新内参基因的需求

5.3.2 miRNA对干旱逆境的响应

第六章 火龙果isomiR的挖掘及靶基因预测

6.1材料与方法

6.1.1数据来源及前期处理

6.1.2 isomiR的挖掘及特征分析

6.1.3火龙果功能性isomiR的挖掘及靶基因PARE预测

6.1.4茎环法定量火龙果isomiR

6.1.5Plant isomiR Atlas的构建

6.1.6Diff isomiRs的构建

6.2结果与分析

6.2.1 isomiR的挖掘及鉴定

6.2.2功能性isomiR的挖掘及靶基因PARE鉴定

6.2.3Plant isomiR Atlas

6.2.4Diff isomiRs

6.3讨论

6.3.1火龙果isomiR序列特征

6.3.2 isomiR参与的非生物逆境响应

6.3.3生物信息学数据库对植物isomiR研究的意义及影响

第七章miRNA/isomiR参与的火龙果干旱响应

7.1 miRNA参与的火龙果干旱响应

7.2 isomiR辅助miRNA参与了火龙果的干旱响应反应

7.3创新点及展望

致谢

参考文献

附录

附录I

在校期间参加的科研项目

附录II

附录1克隆得到的miRNA前体结构及序列示意图

附录2已知miRNA家族成熟序列保守度

附录3 miRNA结合位点降解事件

附录4火龙果miRNA结合位点保守度

附录5Plant isomiR Atlas所用sRNA数据

附录7non-templated isomiR碱基替换倾向性分析

附录8火龙果miRNA前体上的二联体

附录9 isomiR结合位点降解事件

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