ChIFN-ɑ参与百脉根不定根发育的分子机制研究

摘要

根系的形成和发育是牧草产量的重要基础，该过程由若干基因参与调控。来源于动物细胞的调节物质ChIFN-α能促进植物根系形成和发育，但其在植物细胞中的作用机制尚不清楚。论文通过电镜观察、转录组测序和荧光定量PCR等技术，在对ChIFN-α和百脉根根系发育关系研究基础上，进一步探究其在百脉根不定根形成和发育过程中的分子调控机制，以解析动物细胞因子在植物细胞中的作用途径，为植物生长发育调控提供新的选择途径。主要研究内容和结果如下： 1.转ChIFN-α基因百脉根的鉴定分析。通过GUS组织化学活性检测以及基因组PCR扩增检测目的基因，发现外源ChIFN-α基因稳定存在于转基因百脉根（TP）受体植物中。 2.ChIFN-α对百脉根不定根发育的影响。以野生型亲本（WT）为对照，观察比较转ChIFN-α基因百脉根的不定根发育情况。发现在不定根形成及其发育初期的12d观察期内，TP百脉根的不定根比WT提前3d出现，发育较快，且不定根根毛数量多。ChIFN-α基因表达促进受体百脉根不定根的形成和发育。 3.ChIFN-α介导的百脉根不定根发育分子调控网络。水培诱导不定根发育0d、3d、6d、9d和12d的转录水平分析表明，TP百脉根与其WT亲本在根系发育分子调控上的差异表达基因共有16380条，TP百脉根不定根的发育和信号转导、DNA复制、转录翻译等生物过程密切相关，23类WT未显著富集的基因表达模式在TP中被显著富集，差异表达的转录因子中成员最多的ERF、bHLH、MYB、WRKY等家族对于不定根发育和外界胁迫响应均有调控作用。转录组数据分析表明，TP百脉根的基因尤其是发育调控基因表达更丰富、更活跃。ChIFN-α介导的不定根发育通过丰富的调控途径构成多元化的分子调控网络。 4.ChIFN-α介导的根系发育调控途径。转录组分析表明，ChIFN-α介导的不定根发育与膜蛋白基因的差异表达有关。经过外源CaCl2和LaCl3处理，结合转录组和qRT-PCR分析发现，ChIFN-α通过Ca2+响应的C2结构域蛋白激酶（Lj1g3v0026680）参与根系发育调控，其也可能借助Ca2+激活MYB、TALE、Dof等转录因子家族成员，进而促使百脉根根系形成和发育基因转录而进行调控。 5.建立百脉根酵母双杂交体系。通过SMART技术构建了ChIFN-αTP百脉根不定根发育cDNA文库，文库滴度为9.175×108，扩增条带丰富，扩增率为100%。构建了无自激活和对酵母细胞生长无毒的pGBKT7-ChIFN-α诱饵载体质粒，通过Mating法双杂交和缺陷型培养基多轮筛选，获得部分ChIFN-α互作候选阳性克隆。初步建立酵母双杂交体系，可运用于下一步筛选ChIFN-α植物识别/互作蛋白。

目录

缩写词表

第一章 文献综述

1植物根系的研究进展

1.1植物根系的类型

1.2. 不定根的形成和发育

1.3 不定根发育的分子调控研究

1.4 百脉根根系发育及调控研究进展

2植物信号分子及识别研究

2.1 植物多肽细胞信号分子

2.2 互作蛋白的研究方法

3动物细胞调节物质对植物的影响

3.1动物细胞调节物质在植物中的作用

3.2干扰素及其作用机制

3.3干扰素在植物改良中的应用及机制

4选题意义与研究目的

4.1选题意义

4.2研究目的

第二章 材料与方法

1 材料

1.1实验材料

1.2主要试剂及配制

1.3仪器设备

2 方法

2.1 转ChIFN-α基因百脉根的检测

2.2百脉根不定根发育观察

2.3百脉根不定根发育的转录组测序

2.4 转录组数据分析

2.5 转录组差异基因的qRT-PCR检测

2.6 C2基因差异基因筛选与验证

2.7不定根发育相关转录因子筛选与验证

2.8 百脉根酵母双杂交体系构建

第三章 结果与分析

1 转ChIFN-α基因百脉根的鉴定

2 ChIFN-α对百脉根不定根形成和发育的影响

3 ChIFN-ɑ对百脉根根毛发育的影响

4 转基因百脉根中ChIFN-ɑ的含量

5不定根发育的基因转录调控网络

5.1 不定根发育的转录组测序质量

5.2不定根发育调控的差异表达基因数

5.3根系发育调控相关基因的表达模式

5.4参与根系发育的分子调控途径

6 ChIFN-α介导的不定根发育相关差异表达基因特性

7 C2基因参与ChIFN-α介导的根系发育调控

8 参与ChIFN-α介导下的根系发育调控的转录因子

9 百脉根酵母双杂交体系的获得

9.1 百脉根总RNA和制备的cDNA质量

9.2 cDNA文库质量

9.3 酵母双杂交诱饵载体质量

9.4 诱饵载体的毒性和自激活特性

9.5 互作蛋白筛选

第四章 讨论

1 ChIFN-ɑ介导的不定根发育的蛋白激酶调控途径

2 ChIFN-ɑ介导的不定根发育的转录因子调控途径

第五章 总结

1 结论

2 展望

参考文献

致谢

项目资助

研究生期间发表论文及科研成果

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