艾纳香油对脂多糖介导巨噬细胞分泌炎性因子影响机制探讨

摘要

炎症是对多种有害刺激的防御和保护性反应，过度和不受控制的炎症可以导致局部组织损伤甚至全身性损伤，是多种炎性疾病发病机制的基础。我们前期的研究发现艾纳香油有很好的抗炎活性，然而，其潜在的作用机制还不是很清楚。本文研究目的是初步探讨艾纳香油对脂多糖（LPS）介导巨噬细胞分泌炎性因子的影响及其潜在的作用机制。首先利用气-质联用（GC-MS）法分别对5个黔产的艾纳香油进行分析，确定其主要成分，并采用峰面积归一法计算相对百分含量；通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验及过敏性慢反应物质(SRS-A)生成的抑制试验，初步筛选了5个黔产艾纳香油中抗炎活性相对较好的艾纳香油，为后续的研究奠定了物质基础。其次采用MTT法检测抗炎最佳产源的艾纳香油对巨噬细胞的毒性；采用ELISA法检测其对LPS诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）和环氧合酶-2（COX-2）的影响；采用紫外分光光度法检测其对LPS致小鼠腹腔巨噬细胞中一氧化氮（NO）的生成和抑制型一氧化氮合酶（iNOS）活力的影响。最后采用qPCR法检测艾纳香油对LPS诱导巨噬细胞CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、iNOS、COX-2的mRNA相对表达的影响；Western blot法检测艾纳香油对LPS诱导RAW264.7细胞CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、nlrp3的蛋白相对表达量的影响。实验结果表明5个黔产的艾纳香油中左旋龙脑、反式石竹烯、樟脑、石竹烯氧化物、香树烯、花椒素、芳樟醇含量相对较高，且5个黔产艾纳香油共有成分21种；4个黔产的艾纳香油能显著或极显著减少二甲苯致小鼠耳廓肿胀（P＜0.05，P＜0.01），5个黔产的艾纳香油能极显著减少SRS-A生成（P＜0.01），获得1个抗炎最佳黔产的艾纳香油，该艾纳香油对巨噬细胞的IC50值为254.4μg·mL-1，适当浓度的该油能显著或极显著抑制LPS介导的巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、COX-2、NO及iNOS的活力（P＜0.05，P＜0.01），也抑制了CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、iNOS、COX-2mRNA的表达及CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、nlrp3的蛋白相对表达量（P＜0.05，P＜0.01）。结果提示5个黔产艾纳香油各成分含量不同，且具有不同程度的抗炎作用，抗炎最佳产源的艾纳香油作用机制可能是通过LPS-TLR4信号途径抑制NF-κBp65的磷酸化入核，减少PGE2的生成抑制iNOS的活性从而减少NO及TNF-α、IL-1β、IL-6的产生与表达；同时也可能通过抑制LPS活化巨噬细胞内的nlrp3炎症小体通路，从而抑制炎症的发生。本课题结果将为黔产艾纳香油进一步抗炎作用机制深入研究提供理论数据参考。

目录

缩略语

第一章 前言

1 艾纳香油研究进展

1.1 化学成分

1.2 药理活性

1.3 应用

2 炎症与LPS及其信号通路

2.1 LPS概述

2.2 LPS主要受体及其信号传导通路

2.3 nlrp3炎性小体通路

3 选题意义及创新点

第二章 5个黔产艾纳香油主要成分分析及抗炎活性筛选

引言

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 主要药品及试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 GC-MS法对5个黔产艾纳香油主要成分分析

2.2 5个黔产艾纳香油抗炎活性初筛

3 统计学处理

4 结果

4.1 5个黔产艾纳香油化学成分分析结果

4.2 5个黔产艾纳香油的抗炎活性

5 讨论与小结

第三章 艾纳香油对LPS介导的巨噬细胞分泌细胞炎性因子的影响

引言

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验细胞

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 溶剂的配制

2 方法

2.1 巨噬细胞制备与培养

2.2 LPS致巨噬细胞炎性反应的浓度筛选

2.3 筛选不同浓度艾纳香油对巨噬细胞的安全剂量

2.4 ELISA法检测艾纳香油对LPS致巨噬细胞分泌炎性因子的影响

2.5 艾纳香油对LPS致对小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO含量及iNOS活力的影响

3 统计学处理

4 结果

4.1 LPS介导巨噬细胞炎性反应的浓度

4.2 不同浓度艾纳香油对巨噬细胞的安全剂量

4.3 ELISA法检测艾纳香油对LPS介导巨噬细胞分泌炎性因子的结果

4.4 艾纳香油对LPS致对小鼠巨噬细胞分泌NO含量及iNOS活力的结果

5 讨论与小结

第四章 艾纳香油对LPS介导巨噬细胞分泌炎性因子机制的探讨

引言

1 实验材料

1.1 实验细胞

1.2 主要药品及试剂

1.3 主要仪器

1.4 溶剂的配制

2 方法

2.1 qPCR法检测艾纳香油对LPS致RAW264.7细胞分泌炎性因子相关基因mRNA表达的影响

2.2 Western blot法检测艾纳香油对LPS致RAW264.7细胞分泌炎性因子的相关蛋白表达的影响

3 统计学处理

4 结果

4.1 艾纳香油对LPS介导RAW264.7细胞中CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、iNOS、COX-2的mRNA表达的结果

4.2 艾纳香油对 LPS 介导 RAW264.7 细胞分泌炎性因子的CD14、MD-2、TLR4、MyD88、IRAK-1、TAK-1、NF-κBp65、nlrp3相对蛋白表达的结果

5 讨论与小结

第五章 总结与展望

致谢

参考文献

附录

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