铁核桃果实发育过程中酚类代谢的转录组分析

摘要

核桃（Juglans L.）各器官中富含具有很强的生物活性的酚类物质，可清除人体内过剩的自由基，防止DNA、蛋白质及脂质等生物大分子氧化；同时在植物生长发育过程中作为重要的信号分子和化感物质，可抵御紫外线、低温、干旱及昆虫啃食等逆境伤害或与其它植物产生互作，对植株的生理代谢有着重要的调控作用。而关于核桃酚类代谢研究较多的集中在生理机制，对分子机理所知甚少。为此，本研究以铁核桃‘黔核7号’（J.sigillata Dode cv'Qianhe-7'）果实为试材，探究了青皮及种仁发育进程中酚类物质的变化规律，并进行三代全长转录组测序，同时构建花后30天（30d）、90d、140d青皮及90d、120d、140d种仁的表达谱，解析了果实发育进程中调控酚类代谢的相关基因及其与酚类物质变化的关系。为核桃及其它植物酚类代谢相关功能基因的挖掘、调控机制及核桃新品种的选育提供了理论基础。主要研究结果如下： 1、对铁核桃‘黔核7号’果实进行全长转录组测序，得到75232条去冗余全长转录本，平均长度2890.52bp；N50长度为4178bp。获得铁核桃果实发育过程中的参考基因序列，特有的基因序列以及具有完整ORF的重要功能基因转录物序列。Isoform功能注释表明，共有74053条转录本被注释到，占所有Isoform的98.43%；75101条转录被注释到GO数据库，19948条转录本被注释到133个KEGG途径中，54个基因参与了铁核桃果实酚类代谢的调控。 2、表达谱趋势分析及功能注释表明，‘黔核7号’果实发育过程中参与青皮酚类代谢调控的差异基因为20个（BGLU24、SHT、PER43、FLS、PAL、CYP84A1、4CL1、BACOVA_02659、PER64、F3′5′H、COMT1、CAD9、PER17、F3H、BAN、PER73、CCOAOMT、DFR、LAR和ANS），参与种仁酚类代谢调控的差异基因为7个（PAL、PER17、CAD9、COMT1、BGLU40、GSVIVT00023967001和TAT），且表达趋势不同。对23个与酚类代谢相关的差异基因进行q RT-PCR验证，结果表明23个基因与趋势分析结果一致，说明转录组测序结果可靠。WGCNA分析确立了PAL、4CL1和FLS是果实酚类代谢调控的核心基因。 3、‘黔核7号’果实发育过程中青皮中总酚和总黄酮含量总体上呈下降趋势，种仁中呈上升趋势；青皮及种仁中儿茶素含量均最高，且青皮儿茶素和表儿茶素的含量呈上升趋势，其它单体酚含量均在30d较高；种仁中除丁香酸、对香豆酸和阿魏酸外，其余单体酚含量在140d均较高；芦丁、绿原酸含量在种仁较高，但胡桃醌只存在于青皮中；青皮发育过程中，差异表达基因调控的PAL、4CL、FLS和F3H的活性与总酚、总黄酮及大部分单体酚含量的正负相关性较高，而F3′5′H活性则与胡桃醌及除杨梅素外的其它黄酮类单体酚含量的正负相关性较高。 4、差异表达基因可能对酚类物质含量起调控作用，青皮中BGLU24、SHT、PER43、FLS、PAL、CYP84A1、4CL1、BACOVA_02659和PER64的表达利于大部分酚类物质的积累，而与儿茶素、表儿茶素和杨梅素的积累不一致；F3′5′H、COMT1、CAD9、PER17、BAN、PER73和CCOAOMT的表达与除绿原酸、丁香醛、杨梅素外的其酚类物质含量变化不一致；PER73和CCOAOMT的表达利于儿茶素、表儿茶素的合成，但与芦丁含量的变化不一致。种仁中CAD9和COMT1的表达与酚类物质的积累不一致；BGLU40、GSVIVT00023967001和TAT的表达促进除香草酸、阿魏酸和槲皮素外的其它单体酚及总酚、总黄酮积累。PER17的表达虽与总酚、总黄酮、没食子酸、表儿茶素、芦丁、杨梅素和槲皮素含量的积累不一致，但利于其它单体酚的合成。 5、铁核桃果实酚类代谢相关基因功能及通路分析表明，果实酚类代谢起始于莽草酸途径，经苯丙烷途径后走向类黄酮及木质素类物质的合成；此外，由莽草酸途径可直接合成酚酸及水解单宁；研究结果证实了核桃果实中络氨酸代谢途径可合成酚酸类物质，并对类黄酮及木质素的代谢起调控作用。

目录

1 前言

1.1 核桃概述

1.2 酚类物质的结构和分类

1.3 酚类物质的作用及其生物活性

1.4 植物酚类物质代谢及调控机制

1.4.1 酚类物质的合成及代谢过程

1.4.2 酚类物质合成途径相关酶、基因及表达调控

1.4.3 植物酚类物质代谢的转录调控

1.5 转录组测序技术在植物研究中的应用

1.6 本研究的目的和意义

2.1 植物材料

2.2 试验设计

2.2.1 铁核桃果实发育过程中转录组及表达谱文库的构建

2.2.2 铁核桃果实酚类代谢相关基因筛选

2.2.4 铁核桃果实发育过程中参与酚类代谢核心基因的确立

2.2.5 铁核桃果实发育过程中酚类代谢与差异及核心基因的关系

2.3 试剂与设备

2.4 试验方法

2.4.1 RNA的提取与反转录

2.4.2三代全长转录组测序（SMRT, single molecular real time sequencing）和文库构建

2.4.3 三代全长转录组数据组装与生物信息学分析

2.4.4 二代转录组测序及数据质控

2.4.5 铁核桃果实参考基因组的选择与建立

2.4.6 数字基因表达谱的构建及分析

2.4.7 q RT-PCR验证

2.4.8 WGCNA分析

2.4.9 酚类物质及代谢相关酶的检测

2.4.10 图表中字母编号代表的含义

3 结果与分析

3.1 铁核桃果实RNA的质量

3.2 铁核桃果实全长转录组测序、生物信息学分析及酚类代谢的相关基因

3.2.1 全长转录组测序与组装结果

3.2.2 全长转录本功能注释和分类

3.2.3酚类代谢相关基因的筛选

3.3 铁核桃果实发育过程中表达谱分析

3.3.1 数字基因表达谱测序及注释

3.3.2 差异转录本的表达模式

3.4 铁核桃果实发育过程中酚类物质代谢的差异基因

3.4.1 果实发育过程中差异转录本的表达趋势

3.4.2 富集趋势中的酚类代谢通路

3.4.3 果实酚类代谢通路中的差异基因

3.5铁核桃果实酚类代谢差异表达基因的q RT-PCR验证

3.6 铁核桃果实发育过程中酚类代谢的核心基因

3.6.1果实酚类物质共表达模块的构建

3.6.2 核心基因的确立

3.7 不同发育阶段酚类物质代谢相关酶活性的变化

3.8 铁核桃果实不同发育阶段酚类物质含量的变化

3.8.1 总酚总黄酮的变化特征

3.8.2 主要单体酚含量的变化特征

3.9 铁核桃果实不同发育阶段酚类物质含量与相关酶活性的关系

3.10 铁核桃果实不同发育阶段基因表达与酶活性的关系

3.11 铁核桃果实不同发育阶段基因表达量与酚类物质的关系

4 讨论

4.1 铁核桃果实全长转录组测序及功能注释

4.2 铁核桃果实发育过程酚类代谢相关基因及表达差异

4.3 铁核桃果实发育过程中酚类物质、相关酶活性变化及其之间的关系

4.4 铁核桃果实酚类代谢通路及不同器官间酚类代谢相关基因的表达差异

4.5 铁核桃果实发育过程中酚类物质代谢特点

5 结论

参考文献

附录

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致谢

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