利用蛋白质芯片-飞行时间质谱技术筛选结核病、胃癌血清生物标志物及建立诊断模型的实验研究

摘要

研究目的： (1)比较CMlO、IMAC-3-Cu两种芯片结合血清蛋白质的效果。 (2)建立筛选结核病、胃癌血清标志蛋白质的研究方法，分析比较结核病人与正常对照人群、耐药结核病人与正常对照人群、结核耐药与非耐药病人以及胃癌与正常对照人群之间血清差异表达蛋白并初步构建诊断模型。 方法： (1)选择8例结核病患者、8例胃癌患者和8例正常对照人群血清标本，采用CM10、IMAC-3-Cu两种芯片，利用SELDI技术测定三组人群的蛋白质指纹表达谱，分析比较两种芯片结合蛋白质的数量和质量。 (2)收集52例结核病患者，6例耐多药结核病患者，42例胃癌患者和53例正常对照人群血清标本。采用CM10芯片，利用SELDI技术对血清样本进行检测，得到其蛋白质指纹质谱扫描谱，并采用Ciphergen Biosystems软件进行波谱分析。 结果： (1)在2000Da-10000Da，分子量范围内结核组CM10捕获蛋白质53个，IMAC-3-Cu捕获25个；胃癌组CM10捕获136个，IMAC-3-Cu捕获98个；正常对照组CMlO捕获169个，IMAC-3-Cu捕获95个。 (2)TB组与正常对照组蛋白质表达谱比较：从30例TB和30例正常对照血清样本中，共检测到133个蛋白质峰，其中86个在TB与正常对照间的差异有显著意义(P<0.05)。与正常对照组相比，TB组病人血清中有42个蛋白高表达，44个低表达。从检测出的86个差异蛋白中根据重要性分值选择6个建立诊断模型，该诊断模型区分TB与正常对照的准确率98.33％(59/60)，灵敏度96.67％(29/30)，特异度100％(30/30)，阳性预测值100％(29/29)，阴性预测值96.77％(30/31)，ROC曲线下面积为0.983。利用该诊断模型对52例结核患者和53例正常对照人群血清蛋白质指纹质谱数据进行盲法验证，发现该诊断模型对两组人群的盲法验证准确率83.81％(88/105)，灵敏度71.15％(37/52)，特异度96.23％(51/53)，阳性预测值94.87％(37/39)，阴性预测值77.27％(51/66)，盲法验证的ROC曲线下为0.837。 (3)MDR-TB组与正常对照组蛋白质表达谱比较:从6例MDR-TB和30例正常对照血清样本中，共检测到160个蛋白质峰，其中37个在MDR-TB与正常对照间的差异有显著意义(P<0.05)。与正常对照组相比，MDR-TB组病人血清中有9个蛋白高表达，28个低表达。从检测出的37个差异蛋白中根据重要性分值选择6个建立诊断模型，该诊断模型区分MDR-TB与正常对照的准确率100％(36/36)，灵敏度100％(6/6)，特异度100％(30/30)，阳性预测值100％(6/6)，阴性预测值100％(30/30)，ROC曲线下面积为1.000。 (4)MDR-TB组与TB组蛋白表达谱比较：从6例MDR-TB和30例TB血清样本中，共检测到110个蛋白质峰，其中25个在两组人群之间的差异有显著意义(P<0.05)。与TB组相比，MDR-TB组人群血清中有6个蛋白高表达，19个低表达。从检测出的25个差异蛋白中根据重要性分值选择5个建立诊断模型，该诊断模型区分MDR-TB与TB的准确率94.44％(34/36)，灵敏度83.33％(5/6)，特异度96.67％(29/30)，阳性预测值83.33％(5/6)，阴性预测值96.67％(29/30)，ROC曲线下面积为0.900。 (5)胃癌组与正常对照组蛋白表达谱比较：从30例胃癌和30例正常对照血清样本中，共检测到151个蛋白峰，其中53个在胃癌与正常对照间的表达差异有显著意义(P<0.05)。与正常对照组相比，胃癌组血清中有36个蛋白高表达，17个低表达。从检测出的53个差异蛋白中根据重要性分值选择6个建立诊断模型，该诊断模型区分胃癌与正常对照的准确率90％(54/60)，灵敏度80％(24/30)，特异度100％(30/30)，阳性预测值100％(24/24)，阴性预测值83.33(30/36)，ROC曲线下面积为0.900。利用该模型对42例胃癌患者和53例正常对照人群血清蛋白质指纹质谱数据对该模型进行盲法验证，该诊断模型对两组人群的盲法验证准确率96.23％(77/95)，灵敏度61.91％(26/42)，特异度96.23％(5l/53)，阳性预测值92.86％(26/28)，阴性预测值76.12％(51/67)，盲法验证的ROC曲线下面积为0.791。 结论： (1)在三组人群中CM10比IMAC-3-Cu能捕捉得到更多血清蛋白质，在不同分子量组段范围CM10也比IMAC-3-Cu捕捉到更多高峰强度蛋白。 (2)分析比较发现结核病人与正常对照人群、耐药结核病人与正常对照人群、结核耐药与非耐药病人以及胃癌与正常对照人群之间血清蛋白质表达谱差异显著，其中的差异蛋白有可能是TB、MDR-TB和胃癌疾病相关标志蛋白。 (3)SELDI技术具有样品用量小、操作简单、高通量、高灵敏度、高特异度和重复性好的特点，是进行疾病血清差异蛋白筛选研究的理想平台。

目录

论文说明：主要缩略语及中英对照表

声明

绪论

第一章蛋白质芯片的筛选

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章结核病、胃癌血清生物标志物筛选和诊断模型建立

第一部分结核病血清生物标志物筛选和诊断模型建立

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分胃癌血清生物标志物筛选和诊断模型建立

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

总结与展望

参考文献

综述 SELDI-TOF-MS技术及其在传染病研究中的应用进展

致谢