IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究

摘要

本文主要从以下几部分展开： 第一部分： 目的：克隆人白细胞介素2基因(IL-2)，构建重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体。 方法：从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA，设计特异性引物，以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法制备互补DNA(cDNA)模板，以PCR方法扩增IL-2基因，扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy，挑取阳性克隆经鉴定后测序，将测序正确的IL-2基因片段用Bgl Ⅱ和PmeI双酶切消化回收并纯化后定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中。酶切鉴定后通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞，扩增纯化重组腺病毒，并使用TCID50法测定AdBM5-GFP-IL-2重组腺病毒滴度。 结论：成功构建了含IL-2基因的重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-IL-2)，为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础。 第二部分： 目的：探讨IL-2基因转染的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合树突状细胞(DC)对肝癌细胞的杀伤作用。 方法：采用密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞(PMBC)，分别诱导CIK细胞(培养体系：将分离得到的PMBC置于培养箱培养2小时，收集悬浮细胞，采用抗CD3单克隆抗体50ng/ml、rhIL-21000U/ml、rhIL-1 1000U/ml和IFN-Y 1000U/ml联合诱导培养CIK细胞)和DC(培养体系：贴壁细胞经rhIL-4 100ng/ml和rhGM-CSF 100ng/ml诱导培养DC)。用携带IL-2基因的重组腺病毒AdBM5-GFP-IL-2转染CIK细胞(MOI=100)，用HepG2肝癌冻融抗原冲击致敏DC(DC与肝癌抗原的比例为1：20)，然后将转染IL-2基因的CIK细胞(CIKpIL-2)与肝癌抗原致敏DC(DC-Ag)共培养，制备肝癌抗原致敏DC激活的IL-2基因修饰的CIK细胞(DC-Ag-CIKpIL-2)。采用MTT法检测CIK、DC-CIK、DC-Ag-CIK、DC-CIKpIL-2、DC-Ag-CIKpIL-2对肝癌HepG2细胞的杀伤作用，效靶比分别为10：1、20：1、40：1，同时以肝癌细胞H7404、白血病细胞K562作为靶细胞进行杀伤对照实验。 结论：经DC激活的IL-2基因转染的CIK细胞具有更强的抗肝癌作用，本实验为CIK细胞治疗肝癌及肝癌的续继免疫治疗提供实验依据，有一定的指导意义。

目录

论文说明：常用缩略语中英文对照

声明

摘要

前 言

第一部分 人IL-2基因克隆及重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体的构建

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分人IL-2转染的CIK细胞联合DC对肝癌细胞的杀伤作用

实验材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

文献综述：CIK细胞治疗恶性肿瘤的研究进展

在校期间发表论文：人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

致谢