乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究

摘要

卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位，死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处，在发病早期缺乏特异性症状和体征，很难在早期发现和诊断，约60％-70％的卵巢癌患者确诊时己属于晚期。近30年来，虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力，不断改进手术方式，发现更新更好的化疗药物，增加新的化疗方案，但是5年生存率一直徘徊在20％．30％左右。所以，寻找新的诊断方法和新的治疗手段是目前卵巢癌研究的重点。作为一种与粘附和渗出等肿瘤浸润转移必须过程密切相关的物质，乙酰肝素酶(HPSE)在卵巢癌的浸润转移中起着举足轻重的作用。本课题通过一系列体外实验，对HPSE在卵巢癌浸润转移过程中的作用及其机制做了深入的研究，并且构建了HPSE基因慢病毒表达和RNAi载体，为今后的基因靶向治疗奠定了基础。

目录

论文说明：主要英文缩写

声明

致 谢

第一章卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断治疗进展(文献综述)

1卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要步骤

1.1原发恶性肿瘤的浸润

1.2.恶性肿瘤细胞的迁移

1.3恶性肿瘤细胞的转移

2、卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要途径

2.1腹腔种植：

2.2淋巴转移：

2.3影响卵巢肿瘤淋巴结转移的相关因素：

3卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要分子机理

3.1基因调控与卵巢恶性肿瘤的浸润转移:

3.2黏附因子与卵巢恶性肿瘤的浸润转移

3.3血管的生成与卵巢肿瘤的浸润转移

3.4蛋白溶解酶与卵巢恶性肿瘤浸润转移

4卵巢恶性肿瘤浸润转移的临床表现及特点

4.1盆、腹腔种植转移

4.2淋巴结转移

5卵巢恶性肿瘤浸润转移的物理诊断

5.1超声检查在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值

5.2 CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值

5.3 MRI在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值

5.4 PET-CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值

6卵巢恶性肿瘤浸润转移的分子诊断

6.1卵巢恶性肿瘤浸润转移的基因诊断

6.2肿瘤标志物检测

7卵巢恶性肿瘤浸润转移的治疗

7.1手术

7.2卵巢癌的化学治疗

7.3晚期卵巢癌化疗前瞻性多中心随机的临床验证

7.4晚期卵巢癌的靶向治疗(targeted therapy)

8乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的作用

8.1乙酰肝素酶的分子结构

8.2乙酰肝素酶的主要生物学作用

8.3乙酰肝素酶的分子调节机制

8.4乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的生物学作用

9乙酰肝素酶在卵巢癌浸润转移中的作用机理

9.1 HPSE在卵巢癌中的表达

9.2 HPSE表达与卵巢癌组织学类型和组织分化的关系

9.3 HPSE在卵巢癌浸润转移中可能的作用机理

10本研究的目的和意义

第二章乙酰肝素酶基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2引物的设计与合成

1.3实验方法

2、结果

2.1卵巢癌组织总RNA1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 cDNA检测PCR反应产物β-actin1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 HPSE全长扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳结果：

2.4 HPSE全长测序结果

2.5携带HPSE基因的pcDNA3.1与原质粒pcDNA3.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果：

2.6重组质粒HPSE-pcDNA3.1的PCR鉴定及酶切鉴定结果

2.7携带HPSE基因的pcDNA3.1质粒测序结果

3讨论

3.1 HPSE基因的结构特点与测序结果分析

3.2 pcDNA3.1载体选择的意义

3.3 HPSE-pcDNA3.1真核表达载体的构建的意义

第三章乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究

1材料和方法

1.1材料

1.3实验方法

2结果

2.1不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况：

2.2转染条件的确定：

2.3绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1阳性对照结果

2.4筛选A2780细胞的G418浓度的确定

2.5 G418细胞筛选结果

2.6转染筛选出的A2780细胞RT-PCR检测HPSE表达结果

2.7转染筛选出的A2780细胞western-blot检测HPSE蛋白表达结果

2.8转染筛选出的A2780细胞流式细胞仪检测细胞生长周期结果：

2.9细胞集落形成实验结果

2.10转染筛选出的A2780细胞生长曲线结果：

2.11细胞体外迁移能力的测定结果

2.12细胞体外侵袭能力测定结果

2.13细胞体外黏附能力测定

3讨论

第四章RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况：见第二章图2.1。

2.2 shRNA转染SKOV3细胞48小时后在荧光显微镜下结果：

2.3构建好的GADPH-pTG19-T质粒测序结果：

2.4不同shRNA干扰载体对SKOV3细胞HPSE抑制效果的检测结果

2.5标准品QRT-PCR扩增标准曲线结果

2.6标准品测定的实时荧光扩增融解曲线结果：

2.7转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达情况结果

2.8转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达的结果统计学分析结果

2.9 pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222、pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH、pGPU6/GFP/Neo-shNC载体转染SKOV3细胞筛选14天后结果：

2.10 Western-blot检测HPSE蛋白的表达结果

2.11细胞生长曲线测定(MTT法)结果

2.12细胞体集落形成实验结果

2.12细胞体外迁移能力的测定结果

2.13细胞体外侵袭能力测定结果

2.14细胞体外黏附能力测定结果

3 讨论

第五章HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建

1材料与方法

1.1材料

1.2 HPSE引物的设计与合成

1.3实验方法

2结果

2.1 HPSE全长扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳结果：

2.2 HPSE和pWPI连接产物转化HB101后涂板生长结果：

2.3阳性克隆提取的质粒电泳结果：

2.4重组质粒HPSE-pWPI PCR鉴定结果：

2.5重组质粒HPSE-pWPI测序结果：

2.6 HPSE-PWPI转染293T细胞结果

2.7 HPSE-PWPI转染的293T细胞HPSE基因表达结果

2.8 RNAi重组质粒提取结果

2.9 RNAi重组质粒测序结果

3讨论

全文小结

参考文献