黑色素瘤激活因子CXCL1与不同亚型IL-8在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究

摘要

第一章卵巢恶性肿瘤蛋白组学研究现况(文献综述)卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，由于临床症状隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，超过70％的患者就诊时已为晚期，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。肿瘤标志物CA125特异性不强，存在假阳性，不能单独用于卵巢癌筛查。而高通量的蛋白组学技术和生物信息学工具将为卵巢癌生物标志物的大规模快速筛查提供有力武器。 黑色素瘤激活因子CXCL1(GRO-a)和IL-8(CXCL8)同属于趋化因子，多项研究表明，黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8对卵巢恶性肿瘤的发生、信号转导过程等有着重要的影响。本实验室先期发现CXCL1和不同亚型的IL-8蛋白(1-77aa)、(6-77aa)和(9-77aa)可能在卵巢癌的早期诊断中起重要作用。本课题为探讨综合判断CXCL1蛋白和不同亚型IL-8的表达能否成为卵巢癌早期诊断的新标志而努力，旨在推动卵巢癌的诊断由应用单一肿瘤标志物发展成为应用蛋白质谱的改变来进行综合判断。 第二章CXCL1和不同亚型IL-8蛋白的原核表达 目的：通过基因工程技术，扩增出编码CXCL1和不同亚型IL-8成熟肽的基因全长，构建其原核表达载体，表达CXCL1和不同亚型IL-8蛋白。 方法：选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术扩增编码CXCL1和不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的成熟肽基因。将扩增产物与原核表达载体PETSUMO连接，构建原核表达载体并测序鉴定重组子。 结果：成功构建了CXCL1和不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)的原核表达载体，重组子经测序验证同源性均达100％。将其转化至表达菌株表达融合蛋白，后者经镍柱纯化后，通过SUMO蛋白酶酶解去除SUMO载体蛋白，MALDI-TOF-MS的结果证明获得了CXCL1、IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL8(9-77aa)的成熟蛋白。 结论：通过成功表达小分子量的CXCL1和不同亚型IL-8的成熟肽，为课题的深入研究打下了坚实的试验基础。原核表达的产物可用作质谱检测的标准品或作为高纯度的抗原用于制备相应的单克隆抗体等。 第三章激光显微捕获联合免疫磁珠的技术在质谱检测中的应用及CXCL1和不同亚型IL-8蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究 目的：建立一种质谱专一性检测卵巢组织上皮细胞中CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表达的技术方法，以进一步探讨CXCL1及不同亚型IL-8在恶性卵巢肿瘤组织中的表达及其与卵巢恶性肿瘤早期诊断之间的关系。 方法：利用激光显微捕获分别收集卵巢恶性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢组织中的卵巢上皮细胞，裂解细胞蛋白后，通过包被有CXCL1或IL-8抗体的免疫磁珠特异结合上述细胞蛋白裂解液中的CXCL1或各亚型的IL-8蛋白，经微量层析柱浓缩免疫磁珠洗脱液后，采用MALDI-TOF-MS检测免疫磁珠洗脱液中的CXCL1或各亚型的IL-8。 结果：①经激光显微捕获能精确收集到卵巢恶性肿瘤及其良性或正常对照组织中的卵巢上皮细胞，收集到的细胞数量级达105-106。MALDI-TOF-MS检测结果显示免疫磁珠与上述组织细胞裂解液中的CXCL1及不同亚型IL-8结合情况良好，且各亚型的IL-8经质谱可得到较好的区分。②CXCL1在卵巢恶性组织细胞中高表达(阳性率为90％)，在良性及正常对照中不表达。③IL-8(1-77aa)在卵巢恶性、良性、正常组织细胞中均有表达(阳性率分别为40％，100％和66.67％)；IL-8(6-77aa)在卵巢恶性组织细胞中表达(阳性率为30％)，在良性及正常对照中不表达；IL-8(9-77aa)在所有组织细胞样本中均未见表达。 结论：①成功建立了利用质谱专一性研究卵巢组织上皮细胞中CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)表达的技术方法。②CXCL1由恶性卵巢上皮细胞分泌，且可能是较好的潜在肿瘤标志物。③卵巢恶性、良性肿瘤患者和正常人的组织、血清中IL-8蛋白的表达亚型不同，综合判断不同亚型IL-8蛋白的表达在卵巢恶性肿瘤的早期诊断研究中可能有重要价值。

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文摘

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论文说明：主要英文缩写

声明

第一章卵巢恶性肿瘤蛋白组学研究现况(文献综述)

1.卵巢恶性肿瘤概述

1.1卵巢恶性肿瘤的发病率和可能的致病因素

1.2卵巢恶性肿瘤的诊断

1.3卵巢恶性肿瘤治疗的模式及存在的问题

2.蛋白组学的概念及主要研究方法

2.1蛋白组学的概念

2.2蛋白质组学的研究内容及主要的技术路线

2.3蛋白组学的常用技术及原理

3蛋白组学在卵巢肿瘤研究中的应用

3.1 在卵巢癌诊断标记物筛选和鉴定中的应用现况

3.2在卵巢癌治疗靶点筛选鉴定和药物开发中的应用现况

3.3在卵巢癌发病机理研究中的应用现况

3.4蛋白质组学的现状和展望

4.CXCL1与卵巢肿瘤相关性研究

4.1 CXCL1的发现、分子结构和主要的生物学功能

4.2 CXCL1与恶性肿瘤的关糸研究现况

4.3 CXCL1与卵巢恶性肿瘤的关系及分子机理

5.IL-8及亚型与卵巢肿瘤相关性研究

5.1 IL-8的分子结构、各亚型间的区别和主要的生物学功能

5.2 IL-8及亚型与恶性肿瘤的关糸研究现况

5.3 IL-8及亚型与卵巢恶性肿瘤的关糸及分子机理

第二章CXCL1和不同亚型IL-8的原核表达

1.前言

2材料与方法

2.1 材料

2.2引物设计与合成

2.3实验方法

3.结果

3.1 卵巢癌组织总RNA1％琼脂糖凝胶电泳结果

3.2 cDNA质量检测

3.3CXCL1、IL-8（1-77）、IL-8（6-77）和IL-8（9-77）基因扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果

3.4 PCR鉴定连接产物

3.5重组子测序结果

3.6 SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达纯化

3.7 MALDI-TOF-MS鉴定融合蛋白

3.8 Lowry法测定蛋白浓度

3.9 MALDI-TOF-MS鉴定原核表达终产物CXCL1和不同亚型IL-8成熟蛋白的获得

4.讨论

第三章激光显微捕获联合免疫磁珠的技术在质谱检测中的应用及CXCL1和不同亚型IL-8蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的表达研究

1前言

2材料与方法

2.1 材料

2.2方法

3.结果

3.1 激光显微捕获卵巢上皮细胞

3.2 CXCL1、不同亚型IL-8蛋白的标准曲线建立

3.3 CXCL1、不同亚型IL-8蛋白的表达研究

4.讨论

4.1建立质谱联合激光显微捕获和免疫磁珠检测CXCL1及不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)在卵巢恶性肿瘤上皮细胞中表达的技术方法

4.2 CXCL1蛋白在卵巢恶性肿瘤组织中的表达研究

4.3不同亚型IL-8(1-77aa)、IL-8(6-77aa)和IL-8(9-77aa)在卵巢恶性肿瘤组织中的表达研究

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参考文献

致 谢