p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法

摘要

本发明公开了一种p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法，属于细胞和分子生物技术领域。本发明将基因治疗方法用于口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转及其体外评价中，通过向恶性黑色素瘤相关细胞株中引入外源野生型p53基因，可以通过多种机制，依靠多种信号传导通路的综合作用，在抑制细胞增长的同时改变细胞周期分布并诱导细胞发生凋亡，且逆转其转移，侵袭的恶性特征。所述评价方法，简单可靠且科学合理，能够对口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转情况进行全面的检测，可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤发病机理的研究，也可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤相关药物的筛选。

说明书

技术领域

本发明属于细胞和分子生物技术领域，具体涉及rAd-p53在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法。

技术背景

有研究显示在东亚地区原发于头颈部的粘膜恶性黑色素瘤（主要位于口腔）常发生于腭部和上颌牙龈，由于头颈部具有丰富的血供和淋巴引流系统，致使发生于该部位的恶性黑色素瘤极易局部复发和远处转移，因而治疗困难且预后极差。口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞与其他肿瘤细胞相比其恶性程度更高，其治疗和预后更加困难，因此有“癌中之王”之称。

目前对口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞发病机制也并不十分清楚，由于口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞的特殊性，目前对转移性口腔粘膜恶性黑色素瘤患者还没有有效的长期治疗方法。研究发现，标准化疗方案也不能给患者带来显著的长期存活功效。在目前的技术条件下，要开发治疗黑色素瘤的有效方法是极具挑战性的。对传统化疗剂和辐射的高度耐受性是黑色素瘤的特点。现在研究的目标的开始转向确定口腔粘膜恶性黑色素瘤基因突变和信号转导通路的相关扰动，从而希望能开发出具有更好的有效性和更特异性的治疗方法。目前，已经发现对细胞增殖、凋亡及耐药性或转移作用而言很重要的多种细胞通路在口腔粘膜恶性黑色素瘤中均被激活。口腔粘膜恶性黑色素瘤可能导致包括调节功能缺失或者产生抗细胞凋亡功能或增殖功能相关因素在内的多种缺陷（Smalley and Eisen，International Journal of Cancer ，2003；S. CIOLOFAN etc.，Rom J Morphol Embryol ，2011），虽然，目前对相关机制并不完全明确，但开发能够同时抑制多种信号传导通路的治疗手段，有可能为口腔粘膜恶性黑色素瘤的治疗带来新的希望。

基因治疗由于其独特的优势，有望从根本上遏制肿瘤的发展，目前正是肿瘤生物治疗研究的热点。然而，基因治疗作为一种新兴的癌症治疗方法，其技术尚不成熟，对不同种类的癌症的抑制机理也并不明确，针对不同不同种类的癌症的治疗策略也不相同。尤其是对于口腔粘膜恶性黑色素瘤，目前尚没有比较成熟的基因治疗手段，且目前对于口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征逆转的表征方法也并不完善。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法。所述应用和方法可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤治疗手段的初步研究和评价。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用，将p53基因转染到恶性黑色素瘤相关细胞株中。

作为可选方式，在上述应用中，所述基因转染的方式为将装载了p53基因的载体与体外培养恶性黑色素瘤相关细胞株进行共培养或将装载了p53基因的载体输送到恶性黑色素瘤的肿瘤组织中与相关细胞进行接触转染。

作为可选方式，在上述应用中，所述恶性黑色素瘤相关细胞株为人恶性黑色素瘤细胞株（A-375）。

作为可选方式，在上述应用中，所述p53基因为外源野生型p53基因，优选为人p53基因。

作为可选方式，在上述应用中，所述装载了p53基因的载体为重组人p53腺病毒（rAd-p53）。

作为可选方式，在上述应用中，采用其他基因载体（可以是病毒载体也可以是非病毒载体）代替腺病毒。

作为可选方式，在上述应用中，将装载了p53基因的载体制作成注射液，通过注射方式将装载了p53基因的载体输送到恶性黑色素瘤的肿瘤组织中与相关细胞进行接触转染。

作为可选方式，在上述应用中，通过改变恶性黑色素瘤相关细胞的形态，使其出现典型的病理学变化，来抑制其生长，逆转其恶性特征。

作为可选方式，在上述应用中，通过改变恶性黑色素瘤相关细胞的细胞周期，通过G1期阻滞效果，促进其凋亡，来进一步逆转其恶性特征。

作为可选方式，在上述应用中，通过促进恶性黑色素瘤相关细胞中p53和p21^CIP/WAF的mRNA及蛋白的表达，以及抑制bcl-2的mRNA及蛋白的表达，来进一步逆转其恶性特征。

作为可选方式，在上述应用中，通过抑制恶性黑色素瘤相关细胞内基质金属蛋白酶MMP-9的表达，来逆转其转移，侵袭的恶性特征。

本发明还提供了一种口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征逆转的体外评价方法，包括以下步骤：采用p53基因转染恶性黑色素瘤相关细胞株，然后对转染后的恶性黑色素瘤相关细胞株的恶性特征逆转情况进行检测。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用装载了p53基因的载体与体外培养恶性黑色素瘤相关细胞株进行共培养实现接触转染。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性黑色素瘤相关细胞株为人恶性黑色素瘤细胞株（A-375）。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述p53基因为外源野生型p53基因，优选为人p53基因。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用重组人p53腺病毒（rAd-p53）进行基因转染。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用其他基因载体（可以是病毒载体也可以是非病毒载体）代替腺病毒。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，还包括采用带有标记蛋白基因的相应载体转染恶性黑色素瘤相关细胞株，检测载体对所述恶性黑色素瘤相关细胞株的转染效率。作为可选，所述标记蛋白基因为荧光蛋白基因。作为可选方式，所述方法中还包括采用带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（rAd-GFP）转染恶性黑色素瘤相关细胞株，检测腺病毒对所述恶性黑色素瘤相关细胞株的转染效率。作为可选方式，检测不同感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）条件（MOI=0、25、50、100、200、500）下，载体的转染效率，从而对MOI值进行筛选。优选MOI=100。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转染后的细胞增殖抑制率。检测不同感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）条件（MOI=0、25、50、100、200、500）下，进行p53基因转染所产生的细胞增殖抑制率，从而对MOI值进行筛选。优选MOI=100。作为可选方式，采用MTT法或CCK-8法等方法对细胞增殖情况进行定量检测。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检转染后细胞p53蛋白的表达。作为可选方式，采用免疫细胞化学染色法检测p53蛋白的表达。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括观察转染后细胞的形态学变化。作为可选方式，采用倒置显微镜进行细胞的形态学观察，也可采用扫描电镜或透射电镜等其他方式。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测细胞周期及细胞凋亡率。作为可选方式，采用流式细胞仪进行细胞周期及细胞凋亡率检测。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转染细胞后p53和/或p21和/或bcl-2 基因的mRNA及蛋白的表达变化。作为可选方式，采用荧光实时定量PCR进行检测。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转染后细胞内基质金属蛋白酶MMP-9的表达。作为可选方式，采用免疫细胞化学染色法进行检测。

作为可选方式，在上述体外评价方法中，根据需要设置相应的对照。如设置空白对照和/或阴性对照组或在转染前后分别进行相应的检测。具体对照组的设置是本领域技术人员根据数据对比需要和本领域公知常识和现有技术可以灵活调整的。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

本发明将基因治疗方法用于口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转及其体外评价中，通过向恶性黑色素瘤相关细胞株中引入外源野生型p53基因，可以通过多种机制，依靠多种信号传导通路的综合作用，在抑制细胞增长的同时改变细胞周期分布并诱导细胞发生凋亡，且逆转其转移，侵袭的恶性特征。所述评价方法，简单可靠且科学合理，能够对口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转情况进行全面的检测，可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤发病机理的研究，也可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤相关药物的筛选。

附图说明：

图1为实施例1中进入对数生长期的A-375细胞在100倍（左）和200倍（右）镜下正常生长照片；

图2为实施例2中MOI=100条件下，GFP的表达结果，其中左侧为倒置显微镜绿色荧光观察结果，右侧为同一视野下倒置显微镜可见光观察结果，放大倍数均为200倍；

图3为实施例2中不同MOI条件下的腺病毒转染效率柱状图；

图4为实施例3中rAd-p53对A-375细胞活性抑制的时效曲线；

图5为实施例4中rAd-p53转染后A-375细胞p53蛋白的表达结果照片，其中左侧为空白对照组未见p53蛋白表达，右侧为rAd-p53（MOI＝100）转染后48h的A-375细胞。

图6为实施例5中A-375细胞在rAd-p53转染24小时（左）和72小时（右）后在倒置显微镜下观察的照片，放大倍数200倍；

图7为实施例6中所述流式细胞术检测得到的细胞凋亡结果图，其中左侧为空白对照，中间为转染后24h，右侧为转染后72h；

图8为实施例6中所述流式细胞术检测得到的细胞周期分布结果图，其中左侧为空白对照，中间为转染后24h，右侧为转染后72h；

图9为实施例7中所述RT-PCR的检测结果图；

图10为实施例8中所述免疫细胞化学染色检测rAd-p53转染后A-375细胞MMP-9的表达结果图，其中左侧为空白对照，右侧为转染24h后；

图11为实施例9中所示在患者治疗前后采用免疫组化染色检测p53的表达的照片，其中左侧为患处外观，中间为治疗前的免疫组化染色照片，右侧为治疗后的免疫组化染色照片。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1  人恶性黑色素瘤细胞株（A-375）的传代与培养

取冻存的A375细胞进行复苏，加入RPMI1640（含10%小牛血清）细胞培养液进行培养，观察细胞，待培养瓶中80%长满时传代。

图1为进入对数生长期的A-375细胞在100倍和200倍镜下正常生长照片。从图中可以看出细胞生长良好。

实施例2 测定rAd-GFP对A-375的转染效率

取实施例1中复苏的A-375细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中24小时细胞贴壁后，吸去上清，用采用带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（rAd-GFP）病毒液以MOI=0、25、50、100、200、500感染细胞。48小时后，在荧光显微镜下每孔分别随机选择3个200视野计数呈现绿色荧光的GFP阳性细胞数，同时在可见光下计数该视野内的总细胞数，根据公式计算转染率（转染率r＝GFP阳性细胞数/该视野内的总细胞数）。

结果如图2和图3所示，转染Ad-GFP后10～12小时，A-375细胞在荧光显微镜下开始出现绿色荧光，转染后48～72小时荧光强度最强，转染后7～8天逐渐衰减；随着MOI的增加，染色阳性率亦增加。当MOI＝25、50、100 时, 转染率分别为30%左右、75%左右和95%左右，统计学分析显示腺病毒的转染效率与病毒滴度呈明显的正相关（r＝0.849, P＜0.01）。然而随着病毒滴度的进一步增加，当MOI＝200、500时，转染效率升高已不明显（r＝0.124, P＞0.05）。

实施例3  MTT法检测不同rAd-p53转染强度下A-375细胞的生长抑制率

取实施例1中复苏的A-375细胞，以5×10⁴/孔接种于96孔板，常规培养24小时细胞贴壁后，吸去培养液，按MOI=0、25、50、100、200、500加入重组人p53腺病毒（rAd-p53）注射液，设rAd-p53组、空白对照组（只加完全培养液），每组每浓度设立三个平行孔。

采用MTT染色法检测细胞的生长抑制率，用多孔高效分析仪在570nm波长条件下分别测定第24、48、72、96、120小时的光密度（optical density，OD）值,并计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率＝(对照组OD值－处理组OD值)/对照组OD值×100%。结果如表1所示。rAd-p53对A-375细胞的生长具有明显的干扰作用，在同一时间点，所有实验组与对照组相比，OD值差异均有统计学意义（P<0.05）。图4为rAd-p53对A-375细胞活性抑制的时效曲线。由图中可见，随着rAd-p53滴度的增加，各实验组与相同时间点对照组相比，细胞增殖抑制率逐渐增大；MOI=25,50时，细胞生长抑制率较弱；MOI=100组，细胞增殖抑制率上升明显至120小时，抑制率为80.25%；MOI=200、500组，在96小时和120小时两个时间点，与MOI=100组相比剂量虽增加，但效应不再继续增强。

表1各组MTT法检测结果（OD值）

实施例4 免疫细胞化学染色检测rAd-p53转染后A-375细胞p53蛋白的表达

细胞接种：取实施例1中复苏的A-375细胞，以1×10⁵/孔的密度接种于加入玻片的6孔培养板中，按MOI=100加入rAd-p53，设rAd-p53组、空白对照组。培养48小时后，进行免疫组化染色。

阳性判断：P53蛋白为一种核磷酸蛋白，因此显微镜下观察，阳性细胞应可见细胞核内有棕黄色染色颗粒。

结果如图5所示，几乎所有转染后的A-375细胞中均呈现p53蛋白的阳性表达。阳性产物定位于所有A-375细胞的胞核，呈棕黄色颗粒，而空白对照组均未见p53蛋白表达。

在实施例1~4中，由于采用的rAd-p53试剂为不携带GFP的临床成品药物，因此首先采用rAd-GFP来初步确定A-375细胞对腺病毒转染的敏感性，同时通过MTT比色实验及免疫细胞化学染色实验来进一步确定rAd-p53对A-375细胞的转染效率，这样可以从三个方面证实结果的可靠性。

通过上述实施例表明：腺病毒可有效的将外源野生型p53基因转入恶性黑色素瘤细胞A-375；MOI=100可作为rAd-p53对A-375细胞转染的理想滴度，能获得较高且稳定的转染效率；rAd-p53对A-375细胞的生长有抑制作用，并且随着时间的延长和剂量的增加，增殖抑制效果增强，呈现出显著的时间-效应和剂量-效应关系，MOI=100条件下， 120小时的增殖抑制效应（效能）在80%以上。

实施例5 倒置显微镜观察rAd-p53转染A-375细胞后形态学变化

取实施例1中复苏的A-375细胞，以5×10⁴/孔接种于96孔板，常规培养24小时细胞贴壁后，吸去培养液，按MOI=100加入重组人p53腺病毒（rAd-p53）液，以正常培养的A-375细胞作为空白对照，在倒置显微镜下观察细胞形态。rAd-p53转染24小时后，A-375细胞形态和生长方式即发生变化，并随着时间的推移愈发明显，转染72小时后，出现典型的病理学变化 。至72小时，A-375细胞排列松散，缩小变圆，轮廓不清，胞浆中出现空泡，胞核固缩，部分胞膜不完整，从成群细胞中脱落，呈圆形悬浮于培养液中。 部分结果见图6。

实施例6 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率

取实施例1中复苏的A-375细胞，以5×10⁴/孔接种于96孔板，常规培养24小时细胞贴壁后，吸去培养液，按MOI=100加入重组人p53腺病毒（rAd-p53）液，取转染后24小时及72小时的悬浮及贴壁细胞，采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率。以正常培养A-375空白对照。实验组及对照组均为3孔，最后结果为3孔的平均值。

通过流式细胞术检测了A-375细胞经rAd-p53转染后的细胞凋亡情况。细胞凋亡检测结果图7所示，rAd-p53组细胞凋亡百分率均大于对照组，尤其在转染后72h，大部分A-375细胞发生凋亡。在对照组，未见到明显的亚二倍体凋亡峰；转染24小时后，细胞凋亡百分数有所增加（达到9.4% ），但上升幅度较小； 转染72小时后，我们检测到了明显的凋亡峰，细胞凋亡百分数达35.1%。统计学分析, rAd-p53转染72小时后，A-375细胞凋亡明显，与其他两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。

表2细胞周期分布

细胞周期检测结果如表2和图8所示，通过流式细胞术发现，转染rAd-p53的A-375细胞G1期明显增多，S期明显减少，G2期则无明显变化，三组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明rAd-p53对A-375细胞的凋亡诱导可能是通过G1期的阻滞来实现的，提示rAd-p53对细胞周期的阻断作用可能是促使细胞凋亡的重要前提。

实施例7  rAd-p53转染A-375细胞后p53、p21及bcl-2 mRNA及蛋白的表达变化

取实施例1中复苏的A-375细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中24小时细胞贴壁后，吸去上清，按MOI=100加入重组人p53腺病毒（rAd-p53）注射液，取转染后24小时及72小时的悬浮及贴壁细胞，采用荧光实时定量PCR（RT-PCR）检测rAd-p53转染A-375细胞后p53、p21及bcl-2 mRNA及蛋白的表达变化，主要检测步骤包括：提取总RNA；变性胶电泳质检；纯化总RNA ；逆转录成cDNA；设计引物；常规PCR扩增；荧光实时定量PCR检测。

结果如图9所示，通过RT-PCR方法检测了rAd-p53转染A-375细胞后不同时间p53、p21CIP/WAF及bcl-2在mRNA水平及蛋白水平的表达变化结果显示：在对照组p53mRNA及p53蛋白表达微弱，而在rAd-p53转染24小时后p53mRNA及p53蛋白呈现明显的高表达，72小时后p53mRNA表达降低而p53蛋白持续增高。与p53相似，p21CIP/WAFmRNA及p21CIP/WAF蛋白在rAd-p53转染后较对照组表达明显升高，而bcl-2 mRNA及bcl-2蛋白则在转染后72小时表达明显降低。

实施例8 免疫细胞化学染色检测rAd-p53转染后A-375细胞MMP-9的表达

取实施例1中复苏的A-375细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔培养板中24小时细胞贴壁后，吸去上清，按MOI=100加入重组人p53腺病毒（rAd-p53）注射液，空白对照组加入等量的培养基，培养48小时后，进行免疫细胞化学染色。阳性判断：MMP-9在显微镜下观察，阳性细胞应可见细胞胞浆为棕黄色染色。

结果如图10所示，对照组MMP-9呈阳性表达，细胞胞浆呈棕黄色。而实验组rAd-p53转染后A-375细胞，其MMP-9表达为阴性。说明rAd-p53可以抑制A-375细胞中MMP-9的表达，从而逆转其转移，侵袭的恶性特征。

实施例9 双盲随机对照临床试验

选取65例口腔黏膜恶性黑色素瘤患者（均通过病理检测证实），随机分为两组，其中A组32例，仅采用常规手术治疗；B组33例采用常规手术治疗+ rAd-p53注射治疗共同干预，其中rAd-p53注射治疗具体为术前局部注射5次rAd-p53，术后再注射5次，共10次，每次剂量为1x10¹²Vp。治疗前后采用免疫组化染色检测p53的表达，结果如图11所示，。

术后进行随访（生存者最短随访60个月，最长96个月）。结果显示，A组中5年生存率为5/32，B组中5年生存率为18/32。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。