脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

摘要

目的：探讨survivin反义寡核苷酸对胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。 方法：设计并合成特异性靶向survivin的ASODN及正义寡核苷酸(SODN)，设空白对照组、空脂质体对照组、200nmol/L SODN对照组、50-800nmol/LASODN组。ASODN组ASODN经FAM标记，以阳离子脂质体(Oligofectamine)为载体转染至体外培养的胰腺癌细胞，流式细胞术计数荧光细胞百分率，以荧光细胞百分率最高者为最佳转染效率，依次筛选细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量以及转染的最佳时间；转染24h后荧光显微镜观察转染后的细胞；MTT法测定细胞的抑制率；透射电镜观察细胞超微结构变化；吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察PANC-1细胞凋亡的形态学改变；FCM测细胞凋亡率及细胞周期：细胞免疫组织化学技术检测survivin蛋白的表达。 结果：⑴转染液中ASODN浓度50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、400nmol/L、600nmol/L、800nmol/L时，荧光细胞百分率分别为31.9％、37.4％、41.4％、52.6％、24.2％、11.4％、16.1％、15.5％；⑵接种细胞数量为2×104个/孔、2×105个/孔、2×106个/孔的荧光细胞百分率分别为12％、50.8％和11.2％；⑶转染所用的脂质体量2μl、3μl、4μl时，荧光细胞百分率分别为58.8％、34.0％和23.6％；⑷Survivin ASODN转染后荧光显微镜观察转染后细胞排列松散，细胞之间空隙加大，形态变圆，胞浆中颗粒较多，贴壁细胞生长较少，部分漂浮于培养液中，培养液因此变得较混浊，且随着转染浓度的增加变化更明显；⑸MTT法结果显示：200noml/L的ASODN作用于胰腺癌PANC-1细胞24h、36h、48h后细胞抑制率分别为30.67％、42.67％、61.3％，随着时间延长，细胞抑制率增高，分别作用24、36、48小时后各对照组之间均无统计学差异(P>0.05)；⑹DNA凝胶电泳观察：在电泳图上呈明显的“梯状”条带，而正义组、脂质体空转染组和空白对照组则没有；⑺吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察PANC-1细胞凋亡的形态学改变：细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，其核染色质均高度聚集、断裂或核染色呈新月形聚集于核膜一边，核固缩与断裂，核仁消失；细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失，红色荧光增强；⑻survivin ASODN处理组PANC-1细胞24h后凋亡率为38.1％，正义寡核苷酸(SODN)组为4.16％。细胞周期阻滞于G2/M期；⑼采用免疫组织化学和图像分析半定量法，观察转染后各组survivin蛋白表达的平均灰度值，灰度值越大，着色越浅，表达越低。ASODN组与各对照组之间有显著差异(F=11.84，P<0.05)。 结论：①survivin反义寡核苷酸转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为：接种细胞数量为2×105个/孔，反义寡核苷酸的浓度为200nmol，脂质体的量为2ul；②survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达，抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖，并诱导凋亡。

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综述 以存活素为靶点的反义寡核苷酸在胰腺癌治疗中的研究

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