肿瘤转移相关基因S100A6、Rab5a在宫颈癌中的表达及其临床意义

摘要

目的：淋巴结转移的诊断和处理是宫颈癌治疗过程中的关键影响因素，为了探讨宫颈鳞癌发生淋巴结转移的相关机制，选取了肿瘤转移相关基因S100A6、Rab5a，从mRNA水平和蛋白质水平检测其在宫颈良性病变组(子宫肌瘤全宫切患者)、宫颈癌未合并淋巴结转移组(鳞癌Ⅰ a到Ⅱ b期可手术者)、宫颈癌合并淋巴结转移组(鳞癌Ⅰ a到Ⅱ b期可手术者)患者宫颈组织中的表达情况，分析S100A6和Rab5a与宫颈鳞癌的关系及其临床意义。
　　 方法：本研究分为三组，A组(对照组)：宫颈良性病变组(子宫肌瘤全宫切患者)；B组：宫颈癌未合并淋巴结转移组(鳞癌Ⅰ a到Ⅱ b期可手术者)；C组：宫颈癌合并淋巴结转移组(鳞癌Ⅰ a到Ⅱb期可手术者)。
　　 1、用Trizol一步法提取三组宫颈组织总RNA，后逆转录为cDNA；
　　 2、设计S100A6和Rab5a特异性片段的引物，经PCR、扩增、纯化、回收等一系列步骤，将特异性片段与DH-5a载体连接，构建S100A6和Rab5a特异性片段质粒；
　　 3、实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中的S100A6和Rab5amRNA的表达量；
　　 4、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中S100A6和Rab5a蛋白的表达情况，C组同时检测该两种蛋白在宫颈鳞癌原发肿瘤和转移淋巴结中的表达情况；
　　 5、记录并整理数据，用SPSS 13.0软件分析实验结果。
　　 结果:
　　 1、成功提取宫颈组织总RNA，1％琼脂糖电泳清晰可见RNA的28S、18S和5S带型。Takara公司逆转录试剂盒，成功将RNA逆转录为cDNA，结果可以观察到清楚明亮的DNA条带；
　　 2、通过特异性序列比对及测序，证实成功构建了S100A6特异性片段质粒；
　　 3、通过特异性序列比对及测序，证实成功构建了Rab5a特异性片段质粒；
　　 4、应用实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中S100A6 mRNA的表达情况。A组13例，阳性表达10例，阳性率为76.9％；B组25例，阳性表达22例，阳性率为88％；C组25例，阳性表达23例，阳性率为92％。阳性率三组之间没有显著性差异(P＞0.05)，但就mRNA表达量比较，三组之间有显著性差异(P＜0.05)；
　　 5、应用实时荧光定量PCR技术检测三组宫颈组织中Rab5a mRNA的表达情况。A组13例，阳性表达11例，阳性率为84.6％；B组25例，阳性表达22例，阳性率为88％；C组25例，阳性表达23例，阳性率为92％。阳性率三组之间没有显著性差异(P＞0.05)，但就mRNA表达量比较，三组之间有显著性差异(P＜0.05)；
　　 6、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中S100A6蛋白的表达情况，A组10例，阳性表达1例，阳性率为10％；B组30例，阳性表达7例，阳性率为23.3％；C组30例，原发肿瘤阳性表达16例，阳性率为53.3％，转移淋巴结阳性表达11例，阳性率为36.7％。C组中原发肿瘤与转移淋巴结阳性率没有显著性差异(P＞0.05)，A组与B组阳性率没有显著性差异(P＞0.05)，但A组与C组、B组与C组阳性率有显著性差异(P＜0.05)；
　　 7、应用免疫组织化学技术检测三组宫颈组织中Rab5a蛋白的表达情况，A组10例，阳性表达0例，阳性率为0％；B组30例，阳性表达4例，阳性率为13.3％；C组30例，原发肿瘤阳性表达11例，阳性率为36.7％，转移淋巴结阳性表达1例，阳性率为3.3％。C组中原发肿瘤与转移淋巴结阳性率有显著性差异(P＜0.05)，A组与B组阳性率没有显著性差异(P＞0.05)，但A组与C组、B组与C组阳性率有显著性差异(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1、S100A6 mRNA的表达量随宫颈病变程度加重而上调，并且与宫颈鳞癌浸润及淋巴结转移呈正相关；
　　 2、Rab5a mRNA的表达量上调与宫颈鳞癌的发生发展、浸润及淋巴结转移呈正相关；
　　 3、S100A6蛋白在宫颈鳞癌组织表达明显升高，与宫颈病变恶性程度提高、宫颈鳞癌淋巴结转移呈正相关；
　　 4、Rab5a蛋白在宫颈组织中的表达与宫颈鳞癌的形成及浸润转移呈正相关；
　　 5、S100A6和Rab5a两个基因与宫颈鳞癌发生发展及转移密切相关，可以作为评估宫颈鳞癌浸润、转移及预后的指标之一。
　　 6、S100A6和Rab5a两个蛋白的表达与宫颈病变恶性程度提高、宫颈鳞癌淋巴结转移呈正相关，可以作为评估宫颈鳞癌浸润、转移及预后的指标之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

声明

第一章宫颈癌淋巴结转移的临床研究进展

1.概述

2.淋巴结转移是影响宫颈癌预后的一个重要因素

3.淋巴系统的生理与解剖

4.宫颈癌淋巴结转移的解剖学途径

5.宫颈癌转移细胞特性的基础研究

5.1肿瘤细胞的运动性

5.2肿瘤细胞的粘连性

5.3肿瘤细胞的增殖性

6.宫颈癌的淋巴结转移过程和分子机理

6.1宫颈癌淋巴结转移过程

6.2癌细胞进入淋巴结后的情况和淋巴结的反应

6.3宫颈癌细胞淋巴结转移的生物学特性

6.4恶性肿瘤浸润转移的主要步骤

6.5宫颈癌淋巴结转移的分子机理

7.肿瘤相关基因

7.1肿瘤转移基因(tumer metastatic genes)

7.2肿瘤转移抑制基因

8.黏附因子与恶性肿瘤的浸润转移

8.1层粘连蛋白

8.2钙粘蛋白家族(cadherins)

8.3整合素(integrins)

8.4免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)

8.5选择素(selectins)家族

8.6 CD44

9.血管的生成与肿瘤的浸润转移

9.1血管内皮细胞生长因子(VEGF)

9.2碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)

10.蛋白溶解酶与恶性肿瘤浸润转移

10.1基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)

10.2纤维蛋白溶解酶及其调节因子

10.3组织蛋白酶(cathepsins)

11.宫颈癌淋巴结转移的诊断

11.1超声对转移性淋巴结的诊断价值

11.2 CT对转移性淋巴结的诊断价值

11.3 MRI对转移性淋巴结的诊断价值

11.4 PET对转移性淋巴结的诊断价值

11.5淋巴造影对转移性淋巴结的诊断价值

11.6放射性免疫显像(radioimmunoimaging，R Ⅱ)

11.7免疫组化(IHC)

11.8选择性淋巴结活检及系统性淋巴结清除手术

12.宫颈癌的治疗

12.1手术治疗

12.2放疗

12.3化疗

12.4淋巴化疗

12.5免疫治疗

12.6生物治疗

12.7基因治疗

第二章肿瘤转移相关基因S100A6和RabSa研究进展

1.概述

2.Rab5a基因的研究进展

3.S100A6基因研究进展

4.主要研究内容及拟解决的问题

第三章荧光定量PCR研究宫颈癌S100A6和Rab5a mRNA表达情况

1.目的

2.材料和方法

2.1 PCR原理和背景

2.2宫颈组织来源

2.3主要试剂和配制

2.4实验主要仪器设备

2.5用具处理

3.实验步骤和方法

3.1不同病变分组的宫颈组织总RNA的提取

3.2 cDNA合成

3.3引物的设计

3.4质粒的构建

3.5荧光定量PCR

3.6统计学方法

4.结果

4.1总RNA的定量及纯度测定

4.2扩增S100A6、Rab5a基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况

4.3荧光定量PCR检测宫颈标本中S100A6和Rab5a mRNA的表达量

4.4 PCR产物比对和所构建质粒(DH-5α为载体)的测序结果

4.5荧光定量PCR检测宫颈组织中S100A6 mRNA的表达阳性率

4.6荧光定量PCR检测宫颈组织中的RabSa mRNA的表达阳性率

4.7荧光定量PCR检测宫颈组织中的S100A6 mRNA的表达量

4.8荧光定量PCR技术检测宫颈组织中的Rab5a mRNA的表达量

5.讨论

6.小结

第四章免疫组化技术对宫颈癌S100A6和Rab5a蛋白检验并比较

1.目的

2.材料和方法

2.1原理

2.2材料

2.3主要试剂和设备

2.4 Super PicTure法(一步法)免疫组化染色步骤

3.结果判定

4.结果

4.1组织免疫组化结果

4.2应用免疫组化检测标本组织中S100A6蛋白的表达情况

4.3应用免疫组化检测标本组织中Rab5a蛋白的表达情况

5.讨论

6.小结

参考文献

致谢