艾滋病常见真菌性机会感染筛查基因芯片试剂盒的研制

摘要

艾滋病病毒（HIV病毒）是一种能攻击人体免疫系统的病毒，能引起人体免疫机能降低，从而导致人体对一些致病性真菌易感。有统计表明，90％的艾滋病人死于机会感染。血液真菌感染是AIDS患者最常见的机会性感染，且有较高的发病率及死亡率。艾滋病真菌性机会感染发病常见，但缺乏快速有效的检测产品。分子诊断方法具有速度快、特异性强、灵敏度高的特点，并且能够在早期感染阶段对病原体进行检测。但是传统的分子生物学技术有检测通量低的缺陷，而基因芯片技术具备高通量检测的优势，从而解决了这一难题。
　　目前最常见的致病菌为白色念珠菌、烟曲霉菌、新生隐球菌等。罕见的马尔尼菲青霉菌、卡氏肺孢子菌等真菌的致病率也呈增多趋势。本研究通过对艾滋病流行现状以及艾滋病常见真菌性机会感染现状分析，选取了五种常见机会性感染真菌为检测对象，分别为白色念珠菌、烟曲霉、新型隐球菌、马尔尼菲青霉菌、卡氏肺孢子菌。工作汇报如下。
　　目的：研发一种新型可视化基因芯片产品，可同时检测以下几种真菌性机会感染病原体:马尔尼菲青霉菌、新型隐球菌、白色念珠菌、烟曲霉、卡氏肺孢子菌。为临床提供一种快速有效的检测方法。
　　方法：基于可视化生物芯片技术，分别选取白色念珠菌sap6基因、烟曲霉cyp51A基因、新型隐球菌lac1基因、马尔尼菲青霉菌gasc基因、卡氏肺孢子菌18s基因，并设计和筛选出五种真菌的特异性引物和探针，引物进行生物素标记，将标记好的引物进行多重PCR扩增，PCR扩增产物与醛基玻片上预先固定好的五种真菌特异性探针进行杂交反应。采用可视化生物芯片技术显色，使探针呈现肉眼可见的信号。经过成像仪检测和分析，能特异性的检测出此五种机会性感染真菌。结果：本实验通过筛选最确定5对特异性引物和5条特异性探针，对多重PCR扩增体系进行优化，并对基因芯片的检测性能进行了考察，基因芯片检测灵敏度可达到103 copies/mL。该方法特异性好、灵敏度高并且结果肉眼可见，试验可在5h内完成，操作简便。
　　结论：该基因芯片具有灵敏度高、通量高等特点，可以作为真菌感染临床诊断的一种新方法，为艾滋真菌性机会感染患者的准确诊断提供一种高通量的新方法。

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英文摘要

1前言

2材料与方法

2.1 主要仪器及供试材料

2.1.1 试验仪器

2.1.2 供试试剂

2.1.3 菌种及相关材料

2.1.4 供试菌株的接种培养、提取DNA及保菌

2.1.5 主要溶液及试剂配制

2.2 试验方法

2.2.1 五种真菌引物的设计和筛选

2.2.2 探针的设计和筛选

2.2.3 对称扩增和不对称扩增PCR反应体系及条件

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 基因芯片的杂交、洗涤及可视化检测

2.2.6 参考品的制备

2.2.7 芯片灵敏度评价

3 结果与分析

3.1 引物序列的特异性分析

3.1.1设计的候选引物

3.1.2 设计的候选引物验证结果

3.1.3 引物的序列特异性分析

3.2 探针序列的特异性分析

3.2.1 设计的侯选探针

3.2.2 探针的筛选和验证结果

3.2.3 芯片探针最终阵列的设计

3.3 质粒参考品的分析

3.3.1 构建质粒测序结果

3.3.2 构建质粒测序结果分析

3.4 多重扩增体系的优化

3.4.1反应体系中各引物之间比例的优化结果

3.4.2 多重PCR体系优化杂交结果分析

3.4.3 最终确定的多重PCR反应体系

3.4.4 最终确定的Multiplex RT-PCR反应条件

3.5 灵敏度检测结果及分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢

附录1

附录2

附录3:文献综述:基因芯片技术在艾滋病常见真菌性机会感染检测中的应用

附录四： 在校期间科研情况