MMS2在血管紧张素Ⅱ诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程中的作用

摘要

目的:
　　建立有效的脂质体瞬时转染法，转染小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，沉默大鼠神经干细胞(neural stem cells，NSCs)内甲基磺酸敏感蛋白2(Methyl Methanesulfonate Sensitive2，MMS2)的表达，进而探讨MMS2在血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AⅡ)诱导NSCs向多巴胺(Dopamine，DA)能神经元定向分化过程中的作用。
　　方法:
　　(1)体外分离培养新生鼠大脑来源的NSCs，通过免疫细胞化学方法检测其特异性标志神经上皮干细胞蛋白((neuroepithelial stem cellprotein，Nestin)的表达和鉴定其多向分化潜能，即检测NSCs分化细胞中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(neuron special enolase，NSE)及2，3-环核昔酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase，CNP)的表达;
　　(2)将第二代的NSCs按实验设计分成6组:A:对照组，B:AⅡ组，C:AT1受体拮抗剂ZD7155组，D:AT1受体拮抗剂ZD7155+AⅡ组，E:AT2受体拮抗剂PD123319组，F:AT2受体拮抗剂PD123319+AⅡ组，通过实时荧光定量PCR检测各组NSCs内MMS2mRNA的表达;
　　(3)设计并化学合成针对MMS2基因的3对siRNA分子序列，采用阳离子脂质体法瞬时转染NSCs，运用实时荧光定量PCR检测NSCs内MMS2基因mRNA的表达;
　　(4)按以上实验分组将转染前后的NSCs诱导分化为DA能神经元，通过实时荧光定量PCR方法分别检测转染前后诱导分化的各组细胞酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH) mRNA的表达。
　　结果:
　　(1)体外分离培养的细胞，在NSCs专用培养基中呈悬浮聚集式生长，细胞团表达Nestin，其分化的细胞表达GEAP、NSE和CNP，表明分离培养的细胞为NSCs且具备多向分化潜能;
　　(2)实时荧光定量PCR法检测B组、D组细胞的MMS2基因表达水平明显增高，分别是对照组的4.96倍和3.58倍，差异有统计学意义(P＜0.05)，而C、E和F组MMS2基因表达水平和对照组相比差异无显著性差异(P＞0.05);
　　(3) MMS2-siRNA对大鼠NSCs内MMS2基因的沉默效果在转染后36h达到最大抑制作用;3对特异性MMS2-siRNA序列均有效地抑制了MMS2基因的表达，沉默效率分别为siRNA_234(64±6)％、siRNA_346(84±3)％、siRNA_416(58±5)％，与空白对照组相比均存在显著性差异(P＜0.05); siRNA_346沉默效率最高，可用于后续实验的研究;
　　(4)实时荧光定量PCR法检测未转染的NSCs诱导分化10天后，B组和D组TH基因表达水平明显增高，分别是对照组的4.56倍和3.41倍，差异有统计学意义(P＜0.05)，而C、E和F组TH基因表达水平与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);转染MMS2-siRNA后的NSCs诱导分化10天后，各实验组的TH基因表达水平与对照组相比差异均无显著性差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　(1)体外分离培养的新生鼠脑细胞具备NSCs的生物学特性;
　　(2)靶向MMS2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制NSCs内MMS2基因的表达;
　　(3)AⅡ通过AT2受体使MMS2在NSCs的表达升高并诱导NSCs向DA能神经元分化，MMS2在AⅡ诱导NSCs向DA能神经元定向分化的过程中可能发挥重要作用。

目录

声明

中英文缩略语对照

摘要

前言

1 材料

2 方法

结果

3．1 神经干细胞的分离培养、传代

3．2 免疫细胞化学检测

3．3 实时荧光定量PCR

3．4 AII对神经干细胞MMS2表达的影响

3．5 神经干细胞的转染

3．6 神经干细胞的诱导和分化

讨论

4．1 PD基因治疗的现状

4．2 MMS2基因在NSCs发育及其分化中的作用

4．3 RNA干扰技术的运用

结论

参考文献

综述 神经干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的基因调控研究进展

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢