难治性癫痫细胞模型中整合素alpha2表达的相关研究

摘要

目的:
　　研究体外培养原代新生小鼠海马神经元的方法，观察神经元性状及纯度及通过无镁细胞外液（Mg2+-free media）短暂作用后构建的难治性癫痫细胞模型神经元及神经网络的形态变化，同时检测对照组和模型组整合素alpha2(integrinα2)蛋白及mRNA的表达，探讨体外培养难治性癫痫细胞模型中整合素α2的动态表达变化及意义，为进一步研究难治性癫痫的发病机制提供基础。
　　方法:
　　分离新生24h内的小鼠海马神经元进行体外培养，培养首日采用含10％血清培养液以促进细胞贴壁，之后改用添加B-27的适用于乳鼠神经元的无血清培养液NEUROBASALTM-A Medium培养。利用倒置相差显微镜观察神经元性状。神经微丝蛋白(Neurofilament protein，NF)鉴定神经元。培养至第7天，将海马神经元随机分为两组:
　　(1)正常对照组:维持培养液全量换液一次;
　　(2)难治性癫痫模型组:无镁细胞外液（Mg2+-free media）培养3小时，再恢复维持培养液继续培养。镜下观察神经细胞及神经网络的形态变化。应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-peroxidase method，S-P法）及半定量逆转录聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)检测对照组及模型组12h组，24h组，48h组integrinα2蛋白及mRNA的表达量，利用图像分析软件分别计算各组免疫组化图片平均光密度值(mean IOD)及PCR电泳条带的相对灰度值，并进行统计学分析。
　　结果:
　　(1)、采用该方案培养，大部分神经元24h已贴壁，3d神经网络初步形成，7-14d胞体丰满，光晕佳，神经网络连接紧密分布均匀，为体外培养最佳状态。经NF鉴定，第7d神经元纯度为90％。
　　(2)、无镁细胞外液构建难治性癫痫细胞模型24h后，邻近细胞相互迁移，神经网络呈“网格样”改变，48-72h，部分胞体相互融合。随时间延长，融合圈扩大，细胞老化或者死亡。
　　(3)、S-P法免疫染色后integrinα2蛋白表达主要位于轴突部，胞浆也有，蛋白相对表达量(mean IOD)如下:正常对照组0.033±0.005，模型组12h0.084±0.003，模型组24h0.076±0.018，模型组48h0.077±0.006。与正常对照组相比，模型组神经元3个时间点integrinα2蛋白表达均显著增加(P＜0.05)，12h即达到峰值，其后两个时间点一直维持在较高水平。模型组各时间点之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　(4)、RT-PCR:各组均检测到integrinα2 mRNA的表达，半定量RT-PCR结果显示，正常对照组为0.316±0.039，模型组12h0.435±0.067，模型组24h0.453±0.046，模型组48h0.515±0.054。各时间点的模型组与正常对照组相比，integrinα2 mRNA表达均显著提高(P＜0.05)，模型组各时间点之间差异无显著性(P＞0.05)。
　　结论:
　　(1)采用添加B-27的无血清培养液NEUROBASAL硼-A Medium培养的新生小鼠海马神经细胞状态好，纯度高。
　　(2)经无镁细胞外液处理3h构建的新生小鼠海马神经细胞难治性癫痫细胞模型短期内稳定性良好，并引起了神经细胞及神经网络的形态学变化。
　　(3)体外培养新生小鼠海马神经元难治性癫痫细胞模型integrinα2 mRNA及蛋白的表达水平均有显著提高，短期内处于高表达状态，且与难治性癫痫细胞模型出现细胞迁移及神经网络的“网格样”变化相关。

目录

声明

中英文缩写对照表

摘要

前言

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 体外培养的原代海马神经元形态

2 神经元鉴定及纯度

3 构建难治性癫痫细胞模型后神经元及神经网络的形态学改变

4 免疫组化检测各组Integrin α2的蛋白表达变化

5 RT-PCR检测各组Integrin α2 mRNA的表达变化

讨论

1 难治性癫痫细胞模型条件优化及评价

2 难治性癫痫细胞模型中神经网络重组及integrin α2的表达变化

结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士期间撰写或发表的文章