金黄色葡萄球菌α-溶血素抑制B细胞受体信号通路活化机制的初步研究

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，简称金葡菌，是一种自然界中广泛存在的革兰阳性致病菌，能够引起心内膜炎、败血症、肺炎和脑膜炎等多种疾病。α-溶血素(alpha hemolysin，Hla)是金葡菌致病的关键毒力因子之一，其相对分子质量为33000。作为穿孔毒素(pore forming toxin，PFT)家族成员之一，Hla蛋白在宿主细胞的膜表面形成七聚体的功能形式，穿透细胞膜继而导致细胞裂解。然而很多研究表明，Hla蛋白亦具有非PFT作用，如通过影响免疫细胞进而影响机体免疫系统，但是具体机制尚不清楚。进一步的研究则表明Hla蛋白与细胞膜表面的ADAM10蛋白结合促进七聚体的形成，同时Hla蛋白通过与ADAM10蛋白相互作用抑制A549细胞中Src激酶的磷酸化水平。
　　蛋白激酶Src参与细胞分化、迁移、增殖、存活等多个过程，不仅可影响下游信号的级联反应，也参与了B细胞受体(B cell receptor, BCR)信号转导过程。BCR介导的信号通路对B细胞发育、抗体产生等过程至关重要。
　　本研究的第一部分为金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体蛋白的表达纯化及中和性抗体的制备。具体内容有:
　　1.Hla蛋白的表达纯化及活性验证。通过构建Hla蛋白的表达载体，利用原核表达系统大肠杆菌重组表达Hla蛋白。通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性，验证其对不同种属红细胞的裂解作用的差异。
　　2.Hla蛋白的突变体蛋白HlaH35L的表达纯化及活性验证。通过重叠PCR方法将Hla蛋白除信号肽之外的第35个氨基酸组氨酸(H)替换为亮氨酸(L)，并测定突变体蛋白的溶血活性，结果发现与文献报道一致，其不能够裂解兔红细胞。
　　3.Hla蛋白中和性抗体的制备。制备并纯化Hla蛋白的特异性多克隆抗体，溶血活性检测结果显示Hla蛋白的多克隆抗体能够抑制Hla蛋白介导的兔红细胞裂解作用，表明该抗体具有良好的中和活性。
　　本文的第二部分为Hla蛋白抑制BCR信号通路机制的初步研究。具体内容如下:
　　1.Hla蛋白可与小鼠B细胞系WEHI-231特异性结合。通过流式细胞术和免疫荧光实验证实Hla蛋白可与WEHI-231细胞特异性结合。细胞转染实验则证实该结合部分依赖于Hla蛋白受体ADAM10。同时证实突变体蛋白HlaH35L与Hla蛋白具有一致的结合活性。
　　2.Hla蛋白抑制BCR信号通路机制的初步研究。CCK-8实验结果发现Hla蛋白可以抑制anti-IgM所诱导的WEHI-231细胞凋亡。Western Blotting结果则表明，与A549细胞不同，Hla蛋白及突变体蛋白都能够诱导WEHI-231细胞Src的磷酸化，BCR通路活化则导致Src磷酸化程度降低，Hla蛋白可通过诱导Src的磷酸化继而影响BCR信号通路。综上所述，我们成功获得了纯度较高的金葡菌重组Hla蛋白及其突变体HlaH35L蛋白，制备并纯化了具有良好中和活性的Hla蛋白的特异性多克隆抗体。进一步我们发现，Hla蛋白及突变体蛋白都能够通过结合ADAM10诱导蛋白激酶Src的磷酸化影响BCR通路。我们的研究结果提示除了作为穿孔毒素，Hla蛋白还可以通过诱导Src的磷酸化影响BCR通路，且该过程不依赖于七聚体这样的功能形式。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

一、金葡菌的发现及严重危害性

二、金葡菌α-溶血素与其细胞表面受体ADAM10的研究

三、B细胞受体的相关研究

四、研究思路

第一部分 金黄色葡萄球菌α-溶血素及突变体蛋白的表达、纯化及中和性抗体的制备

1．1 实验材料

1．1．1 菌株与质粒载体

1．1．2 工具酶和试剂盒

1．1．3 主要仪器

1．1．4 试剂配制

1．2 实验方法

1．2．1 pET-28a-hla重组质粒的构建

1．2．2 Hla蛋白在大肠杆菌中进行诱导表达及纯化

1．2．3 Hla蛋白溶血活性验证

1．2．4 多克隆抗体的制备以及抗体效价的测定

1．2．5 多克隆抗体对Hla蛋白溶血活性的抑制

1．2．6 Hla蛋白突变体蛋白HlaH35L的构建

1．2．7 统计学分析

1．3 实验结果

1．3．1 表达载体pET-28a-hla的构建

1．3．2 Hla蛋白的表达和纯化

1．3．3 Hla蛋白对不同物种的红细胞溶血活性测定

1．3．4 Hla蛋白特异性多克隆抗体的制备及中和活性测定

1．3．5 表达载体pET-28a-hlaH35L的构建

1．3．6 HlaH35L蛋白的表达、纯化及溶血活性验证

1．4 讨论

第二部分 Hla蛋白抑制BCR信号通路机制的初步研究

2．1 实验材料

2．1．1 培养基和试剂盒

2．1．2 抗体和主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 Hla／HlaH35L蛋白与A549和WEHI-231细胞结合实验

2．2．3 检测Hla蛋白与A549／WEHI-231细胞结合是否依赖于受体ADAM10

2．2．4 重组蛋白内毒素去除实验

2．2．5 细胞增殖实验

2．2．6 Western Blot检测Hla蛋白及突变体蛋白对BCR相关信号通路影响

2．3 实验结果

2．3．1 ADAM10介导Hla蛋白及其突变体蛋白与A549细胞结合

2．3．2 Hla蛋白可与正常B细胞结合

2．3．3 Hla蛋白及其突变体蛋白可与WEHI-231细胞结合

2．3．4 ADAMl0介导Hla蛋白与WEHI-231细胞结合

2．3．5 Westem Blotting检测Hla蛋白及突变体蛋白对BCR相关信号通路的影响

2．3．6 Hla蛋白可抑制anti-IgM诱导的WEHI-231细胞凋亡

2．3．7 Hla蛋白作用BCR的可能机制

2．4 讨论

结论

参考文献

缩略语

B细胞抗原受体信号通路的激活在B细胞淋巴瘤形成中的作用

致谢

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