HU-308药物涂层对RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化影响的实验研究

摘要

目的：
　　研究不同浓度HU-308药物涂层对破骨细胞形成、分化、凋亡及破骨细胞特征基因mRNA表达的影响，从而为HU-308药物涂层在临床种植牙的应用提供实验依据。
　　方法：
　　一、破骨细胞的诱导培养与鉴定
　　用核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导破骨细胞前体细胞（RAW264.7）向破骨细胞分化，并通过光镜下形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、骨片甲苯胺蓝染色观察吸收陷窝和qPCR检测破骨细胞组织蛋白酶K(CtsK)、TRAP、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因mRNA的表达等方法鉴定成熟破骨细胞。
　　二、HU-308药物涂层对RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化的影响
　　1、实验分组
　　168片纯钛片用NaOH溶液进行碱热处理后，随机分为A、B、C、D、E、F、G、H组，每组21片。A组钛片作为对照组，仅做碱热处理;B组钛片经碱热处理后，通过层层自组装(LBL)技术在其表面制备15层肝素（Hep）/壳聚糖(Chi)涂层;C、D、E、F、G、H组钛片经碱热处理后，通过LBL技术制备15层Hep/Chi涂层，最后分别浸渍于含0.025mg/L、0.25mg/L、2.5mg/L、25mg/L、100mg/L、250mg/L浓度的HU-308溶液中，采用物理吸附法在Hep/Chi涂层上装载HU-308，制备出含不同浓度的HU-308药物涂层。
　　2、不同浓度HU-308药物涂层的筛选
　　A、B、C、D、E、F、G、H组钛片放入孔板中，钛片表面进行RAW264.7的接种培养，培养4d后，采用噻唑蓝(MTT)法，以A组为对照组，比较组间存活细胞数量间差异，选择对RAW264.7增殖能力无明显影响的HU-308药物涂层组进行后续实验。
　　3、HU-308药物涂层对RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化的影响
　　A、B、C、D、E、F组钛片预置于细胞培养板中，RAW264.7悬液接种于孔板中，RANKL诱导培养6d后：1、TRAP染色破骨细胞计数;2、酶动力学法测定破骨细胞TRAP活性;3、qPCR测定破骨细胞CtsK、TRAP、MMP-9基因mRNA的表达;4、流式细术测定破骨细胞的凋亡率。
　　结果：
　　一、破骨细胞的诱导培养与鉴定结果
　　RAW264.7经RANKL诱导培养，TRAP染色后，可见大量红染的多核巨细胞，细胞形态呈荷包蛋样，细胞核数量几个至几十个不等;经甲苯胺蓝染色的骨磨片上可见圆形或椭圆形的骨吸收陷窝形成，陷窝处因染料填入而呈蓝紫色;经RANKL诱导后破骨细胞CtsK、TRAP和MMP-9的mRNA表达量明显上调，分别上调了约23倍、26倍、38倍。
　　因此，RAW264.7在RANKL的诱导作用下可分化为破骨细胞且具有骨吸收功能，结果可靠，可用于进一步的研究工作。
　　二、不同浓度HU-308药物涂层的筛选结果
　　B、C、D、E、F组与A组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);G、H组与A组比较，RAW264.7增殖能力明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。说明Hep/Chi涂层和浸渍浓度为0.025mg/L、0.25mg/L、2.5mg/L、25mg/L的HU-308药物涂层对RAW264.7增殖活性均无明显影响，而浸渍浓度为100mg/L、250mg/L的HU-308药物涂层明显抑制RAW264.7增殖。因此，我们选择A、B、C、D、E、F组进行后续实验。
　　三、HU-308药物涂层对RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化的影响
　　1、破骨细胞数量：
　　各组破骨细胞数目比较，F组＜E组＜D组＜C组＜A组，B组＜A组，差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着HU-308浸渍浓度增加，破骨细胞的体积变小，TRAP染色变浅，破骨细胞成熟度下降;C组破骨细胞数目略低于B组，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2、破骨细胞TRAP活性：
　　各组TRAP活性比较，F组＜E组＜D组＜C组＜B组＜A组，差异有统计学意义(P＜0.05)，随着HU-308浸渍浓度增加，TRAP活性逐渐减低，呈剂量依赖性。
　　3、破骨细胞CtsK、TRAP、MMP-9基因mRNA表达：
　　(1)CtsK：F组＜E组＜D组＜C组＜A组，B组＜A组，差异有统计学意义(P＜0.05);C组与B组比较，表达量稍下降，但差异无统计学意义(P＞0.05);
　　(2)TRAP：F组＜E组＜D组＜C组＜B组＜A组，差异有统计学意义（P＜0.05）;
　　(3)MMP-9：E组＜D组＜C组＜A组，表达量差异有统计学意义(P＜0.05);E、F组之间比较，A、B组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05);
　　4、破骨细胞凋亡率：
　　各组相互比较，E组＞D组＞C组＞A组，差异有统计学意义(P＜0.05);E、F组之间比较，A、B组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　一定浓度的HU-308药物涂层不影响体外破骨细胞前体细胞的增殖，可直接抑制体外破骨细胞的形成、分化，下调破骨细胞CtsK、TRAP、MMP-9基因mRNA的表达水平，促进破骨细胞的凋亡，其作用呈剂量依赖性。

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摘要

前言

实验一 破骨细胞的诱导培养与鉴定

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

实验二 HU-308药物涂层对RANKL诱导RAW264．7向破骨细胞分化的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

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