胶原水凝胶诱导软骨形成的分子生物学机制

摘要

目的:考察胶原水凝胶体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)成软骨的相关信号通路，并进一步研究胶原水凝胶在体内用于软骨缺损修复的相关信号通路，用以研究胶原水凝胶成软骨诱导作用的分子生物学机制。
　　方法:体外分离和培养rBMSCs并复合胶原水凝胶用于构建体外软骨诱导模型，考察胶原水凝胶对rBMSCs软骨诱导过程中信号通路的表达情况。实验分四组:B组为单纯细胞组（阴性对照组），离心方式三维培养的rBMSCs团块，未加软骨诱导因子TGF-β1和胶原水凝胶;BT组为离心方式三维培养rBMSCs，未加胶原水凝胶，添加TGF-β1，作为生长因子组;BC组为胶原材料组，离心方式三维培养rBMSCs+胶原水凝胶;BTC组为阳性对照组，离心方式三维培养rBMSCs+胶原水凝胶，同时添加TGF-β1。每组分别培养14天、28天和42天，提取样品，进行如下检测:1）采用DNA含量检测各组之间的细胞增殖情况;2）苏木素-伊红(HE)染色观察各组的细胞形貌;calcein-AM/PI荧光染色观察细胞存活状况;3）鬼笔环肽/hoechst33258荧光染色观察纤维状肌动蛋白(F-actin)在细胞中的分布和动态变化情况;4）番红O染色和DMMB试剂检测细胞分泌软骨特异基质GAG的含量;5）采用定量qRT-PCR技术检测软骨形成过程中软骨特异性基因(Acan，ColⅠ，ColⅡ，ColⅩ)和相关信号通路主要包括MAPK、Wnt以及Ihh-PTHrP中的关键基因(TβR-Ⅱ，TβR-Ⅰ，Smad2，Smad3，Smad4，Wnt-5a，Ihh和PTHrP)的表达;6）使用免疫组织化学检测Ⅱ型胶原和Ⅰ型胶原和的分泌情况，以检测成软骨程度;7）通过免疫印迹Western Blot检测相关信号通路关键蛋白ERK1/2、p38、N-cadherin、fibronectin等的表达情况。通过以上实验检测手段，以检测胶原水凝胶在体外成软骨诱导能力以及相关分子机制。
　　为了进一步研究胶原水凝胶修复软骨的分子机理，本研究基于兔关节软骨缺损模型，考察胶原水凝胶修复软骨缺损的相关信号通路。实验分组为:空白组（不植入任何细胞和胶原水凝胶），B组(单纯细胞组，植入三维培养的BMSCs)，BT组(生长因子组，植入添加TGF-β1三维培养的BMSC)，BC组（胶原材料组，植入三维培养的胶原水凝胶+rBMSCs），BTC组（阳性对照组，植入添加TGF-β1三维培养的胶原水凝胶+BMSCs）。软骨缺损修复4周、12周和24周后，分别取材，用于以下简称:1）大体标本观察:对取出的软骨修复部位进行大体评分，大体检测软骨缺损修复情况;2）生物力学性能测试检验修复区新生软骨的力学性能;3）使用苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察修复部位的细胞形貌和细胞外基质分泌情况，考察新生软骨情况及与周围组织的界面;4）采用番红O染色检测软骨特异基质GAG的分泌情况;5）分子水平上采用qRT-PCR技术检测软骨形成过程中的软骨特异性基因(Acan，ColⅠ，ColⅡ，ColⅩ)和主要信号通路包括TGF-β、MAPK、Wnt以及Ihh-PTHrP中涉及到的各信号分子(TβR-Ⅱ，TβR-Ⅰ，Smad2，Smad3，Smad4，Wnt-5a，Ihh和PTHrP)的表达情况;6）使用免疫组织化学检测软骨组织Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的分泌情况。通过以上实验检测手段，以判断体内兔关节软骨缺损模型修复情况以及修复过程中的相关信号通路。
　　结果:通过体外构建材料诱导软骨模型，考察胶原水凝胶诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨形成过程中的相关信号通路。1）通过组织学(HE染色，番红O染色，calcein-AM/PI荧光染色和鬼笔环肽/hoechst33258荧光染色）和生化检测（DNA含量和GAG含量检测）可知，BTC组（阳性对照组）诱导效果最好，BC组（材料组）的诱导结果优于或相近BT组（生长因子组），说明胶原水凝胶材料具有软骨诱导作用，且其诱导效果与生长因子接近，二者共同参与软骨诱导过程。2）通过免疫组织化学染色及PCR检测可知，BC组（材料组）的软骨特异性基质—蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达优于或相近BT组（生长因子组），说明胶原水凝胶材料具有软骨诱导作用，与生长因子效果接近;相对于B组（阴性对照组）和BT组（生长因子组），BC组（材料组）Ⅰ型胶原的表达更低，说明胶原水凝胶材料更能维持软骨表型，对于防止去分化更为有效。X型胶原未能在各个组中检测到，说明各组成骨分化倾向轻微。3）软骨诱导相关信号通路MAPK和Wnt中涉及到的各信号分子PCR结果表明，信号分子的表达在BT组（生长因子组），BC组（材料组）与BTC组（阳性对照组）表达均显著优于B组（阴性对照组），说明生长因子和材料均有软骨诱导作用;BC组（材料组）的表达优于或相近BT组（生长因子组），BTC组（阳性对照组）表达效果最好。4)免疫印迹Western Blot检测ERK1/2、p38、N-cadherin、fibronectin等蛋白水平表达，结果表明， BC组（材料组）p38、N-cadherin、fibronectin蛋白水平上调，而ERK1/2蛋白水平下调，说明胶原材料能够通过促进黏连蛋白N-cadherin和fibronectin的分泌和调节MAPK信号通路(ERK1/2、p38)促进细胞聚集生长。以上结果说明胶原材料具有与生长因子相近的软骨诱导作用，且可以通过调节TGF-β、MAPK、Wnt和Ihh-PTHrP信号通路诱导软骨形成。
　　体内构建软骨缺损模型，通过大体标本观察、新生软骨生物力学性能测试以及组织学染色（HE染色、番红O染色和Masson染色）及组织学评分结果可知，空白组基本不修复，说明该尺寸的软骨缺损难以自我修复;BT组（生长因子组），BC组（材料组）与BTC组（阳性对照组）关节软骨缺损修复效果均比空白组和B组更好，BC组（材料组）的修复效果优于BT组（生长因子组）。通过免疫组化染色及PCR检测可知，BC组（材料组）的软骨特异性基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达明显优于（生长因子组），说明材料在关节软骨修复中不可或缺，其作用比生长因子更好。相对于B组和BT组，BC组（材料组）Ⅰ型胶原的表达更低，说明胶原水凝胶材料对于维持软骨表型，防止去分化更为有效。X型胶原未能在各个组中检测到，说明成骨分化倾向轻微。信号通路涉及到的各信号分子PCR结果表明，信号分子的表达在BC组（材料组）与BTC组（阳性对照组）表达含量均比B组和BT组更好，说明胶原材料可以通过调节TGF-β，Wnt和Ihh-PTHrP信号通路诱导软骨形成。
　　结论:胶原水凝胶可诱导软骨形成，并能有效修复膝关节软骨缺损;胶原水凝胶成软骨过程中，与TGF-β信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、Ihh-PTHrP信号通路相关;结果表明在各个软骨形成阶段，在体外胶原水凝胶诱导软骨与生长因子TGF-β诱导软骨机制较为接近，在体内胶原的软骨诱导作用比生长因子更好，因此材料可取代生长因子的作用，通过优化设计材料可实现软骨的全面修复。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

参考文献

第一部分 胶原水凝胶诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨体外模型的建立及分子机制研究

1 材料与方法

2 实验结果与分析

3 讨论

参考文献

第二部分 胶原水凝胶在体内成软骨诱导的相关信号通路

1 实验材料

2 实验方法

3．结果

4 讨论

5．结论

参考文献

附录

综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文