富血小板血浆复合胶原水凝胶诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化作用的研究

摘要

关节软骨缺损在临床中较为常见，因关节软骨缺乏神经血管分布、再生能力差，当关节软骨出现损伤后极难自我修复，因此软骨缺损的彻底治愈成为了临床治疗和基础研究的难点和热点。随着组织工程学和再生医学对软骨缺损研究的不断深入，为软骨缺损的修复提供了更为合适的治疗方案。本实验以兔的BMSCs作为软骨缺损修复的种子细胞，胶原水凝胶作为组织工程化软骨的支架材料，以自体富血小板血浆作为细胞的生长因子，三者共同构建组织工程软骨，观察其体内外成软骨和软骨修复的效果。
　　第一部分 PRP复合BMSCs/胶原水凝胶(COL)在体外成软骨诱导中的作用
　　目的：PRP复合BMSCs/COL构建组织工程化软骨，观察PRP激活后释放的生长因子对组织工程化软骨中细胞增殖、分化及细胞外基质分泌的情况。
　　方法：采用Ⅰ型胶制备胶原水凝胶，取三代间充质干细胞与胶原水凝胶混匀构建三维程组织，取兔外周血经二次离心提取富血小板血浆，并加入CaCl2激活。实验分组:BC组为胶原材料组，第三代BMSCs与COL构建组织工程化软骨;BCT组为第三代BMSCs与COL构建组织工程化软骨，添加含有TGF-β的软骨诱导液进行培养;BCP组为第三代BMSCs与COL构建组织工程化软骨，加入PRP提取液培养。各组培养7D、14D、21D，每个天数提取样品，进行以下相关检测:1、DNA含量的检测对比各组组织工程化软骨中细胞的增殖情况;2、行HE染色，观察各组组织工程化软骨中细胞形态变化;3、行钙黄绿素-PI荧光染色，对比各组组织工程化软骨中细胞的存活状况;4、鬼笔环肽-hoechst33258荧光染色，对比各组组织工程化软骨中纤维状肌动蛋白(F-actin)的分布情况;5、番红O染色和DMMB试剂检测，对比各组组织工程化软骨中细胞分泌的软骨特异基质GAG含量的不同;6、利用qRT-PCR技术，检测各组组织工程化软骨形成过程中，各组软骨特异性基因(ColⅡ，Acan，ColⅠ，SOX9)的变化;7、使用免疫组织化学染色检测各组组织工程化软骨中Ⅱ型胶原的分泌情况，以检测成软骨程度。
　　结果：1、通过组织学染色(HE染色，钙黄绿素-PI荧光染色，番红O染色和鬼笔环肽-hoechst33258荧光染色)可知，BC组、BCP组、BCT组均成软骨分化，BCP组诱导效果比BC组好，说明添加富血小板血浆后诱导效果更明显，PRP与胶原水凝胶二者协同参与软骨诱导过程可以起到更好的效果。2、通过生化检测(DNA含量和GAG含量检测)可知，BCP组细胞增殖较BCT组及BC组高，说明富血小板血浆经激活后释放的生长因子具有促进BMSCs增殖的作用。3、免疫组织化学COLⅡ染色和RT-PCR基因检测可知，BCP组中软骨特异性基质蛋白聚糖和COLⅡ的表达优于BC组，这说明了富血小板血浆联合胶原材料可增加间充质干细胞向软骨分化的效果。相对于BCT组，BCP组Ⅰ型胶原的表达更低，说明富血小板血浆能维持软骨表型，防止软骨去分化。
　　结论：1、自体来源PRP可促进BMSCs细胞增殖，并提高细胞活性;2、自体来源PRP促进体外BMSCs软骨特异性基因的表达及细胞外基质分泌，从而诱导软骨形成;3、自体来源PRP促软骨形成时效与TGF-β1相当，此外，其Ⅰ型胶原表达较TGF-β1低，说明其可以较好维持组织工程软骨表型。
　　第二部分 PRP复合BMSCs/collagen在膝关节软骨缺损修复中的作用
　　目的：探索PRP复合BMSCs/collagen构建组织工程化软骨修复关节软骨缺损的可行性。
　　方法：首先经二次离心提取PRP，采用梯度密度离心法提取BMSCs，培养三代后与胶原水凝胶构建组织工程化软骨，制造兔膝关节软骨缺损模型。实验分组:BC组，植入BMSCS/collagen组织工程化软骨;BCT组，植入BMSCs/collagen组织工程化软骨，关节内注射自体TGF-β;BCP组，植入BMSCs/collagen组织工程化软骨，关节内注射自体PRP。各组培养8周后取材行以下检测:1、体标本观察:观察软骨缺损的修复情况，对软骨修复部位进行大体评分;2、番红-固绿染色观察修复部位的细胞形貌和细胞外基质分泌情况，考察新生软骨情况及与周围组织的界面;3、通过大体评分和组织学评分对比各组软骨缺损修复情况;4、通过免疫印迹Western Blot检测缺损修复部位中组织工程化软骨特异性蛋白COL2A1的表达。
　　结果：通过构建动物体内软骨缺损模型，结合大体标本观察、组织学染色（番红-固绿染色）及大体和组织学评分结果可知，BC组（对照组），BCT组（阳性对照组）与BCP组（实验组）对关节软骨均有修复，相对于BC组，BCP组的修复效果更优。通过免疫印迹Western Blot检测检测可知，BCP组（实验组）的软骨特异性蛋白Ⅱ型胶原表达明显优于BC组（对照组），说明材料、种子细胞、生长因子共同修复关节软骨更具有优势。
　　结论：1、自体来源的PRP复合BMSCs及Col可有效促进关节软骨缺损修复及新生软骨细胞外基质分泌;2、自体来源的PRP促进关节软骨修复效果与TGF-β1相当。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

参考文献

第一部分 PRP复合BMSCs／collagen在体外成软骨诱导中的作用

1 材料

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 PRP复合BMSCs／collagen在膝关节软骨缺损修复中的作用

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

综述

致谢

攻读硕士期间发表的论文