厄贝沙坦对胞内胞外氧化应激引起胰岛NIT-1细胞损伤的研究

摘要

目的:胰岛β细胞的损伤和凋亡是糖尿病发病的机理之一，引起机体胰岛素分泌相对或绝对不足从而出现高血糖状态。与其他组织细胞相比，胰岛β细胞的抗氧化能力水平低。有研究报道高糖、高脂、炎性因子、链脲佐菌素、过氧化氢等均可引起胰岛β细胞发生凋亡或坏死。随着对糖尿病发病机制的不断研究，有研究发现，在胰岛β细胞的微生存环境中，高糖、高脂、炎性因子等在引起胰岛β细胞凋亡或坏死的同时伴有肾素-血管紧张素系统(Renin Angiotensin System，RAS)的激活。而目前已有大量的基础研究证实在人、大鼠、小鼠、犬类等多种动物的胰腺上均存在合成血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的独立体系，并在胰腺局部发挥重要的调控作用。胰腺局部的RAS具有自身的特点，不依赖于肾脏，可以自身合成、释放，并通过胞内分泌、旁分泌、自分泌的方式来发挥对细胞的生长、分化、增殖、凋亡，组织炎症及纤维化等的生理及病理生理作用。近年有循证医学研究证实，使用血管紧张素受体拮抗剂(Angiotensinreceptor blocker, ARB)、血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin-convertingenzyme inhibitor, ACEI)，可以有效降低具有高危因素（肥胖、心血管疾病、吸烟等）患者新发2型糖尿病的风险，其具体机制目前尚不清楚。本课题组的前期研究也证实血管紧张素受体1（AT1受体）拮抗剂厄贝沙坦可以拮抗高糖环境中胰岛β细胞凋亡，其可能机制与抑制AT1R、AngⅡ mRNA表达，阻断RAS通路，以及抗氧化和下调凋亡相关基因Bax、Caspase-3mRNA的表达有关。本实验选择NOD小鼠胰岛细胞瘤NIT-1胰岛细胞，它具有胰岛β细胞的功能，体外培养以存活，并通过不同途径来源的氧化应激因素链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)及过氧化氢(H2O2)诱导胰岛NIT-1细胞损伤，建立胰岛细胞内和细胞外氧化损伤模型，进一步进行厄贝沙坦对凋亡胰岛NIT-1细胞观察研究。本研究内容分为两部分:第一部分是建立胞内胞外胰岛NIT-1细胞损伤模型，第二部分是厄贝沙坦对链脲佐菌素及过氧化氢诱导胰岛NIT-1细胞凋亡的影响，为临床开展糖尿病的病因治疗、指导糖尿病的防治提供实验及理论依据。
　　材料和方法:本实验设计分为两部分，第一部分是建立胞内胞外胰岛NIT-1细胞损伤模型:选取对数生长期的NOD小鼠胰岛β细胞株NIT-1细胞，分别加入STZ和H2O2干预。第二部分是根据第一部分建立所得的NIT-1胰岛β细胞凋亡模型基础上，在上部分内容的基础上分别选取终浓度为2mmol/LSTZ、300μmol/L的H2O2干预细胞30min，弃干预液，分别加入不同浓度(0.1、0.01、0.001mmol/L及0mmo/L即无厄贝沙坦的阳性组)的厄贝沙坦培养液，按厄贝沙坦浓度分组。根据不同实验要求，第一部分实验内容:收集各组细胞，采用Hochest33342荧光染色法观察各组细胞的凋亡形态，流式凋亡检测技术检测各组细胞的凋亡率，在所测得流式细胞凋亡率的基础上，选择诱导胰岛NIT-1细胞凋亡率适中的STZ及H2O2浓度组即（B组和D组）继续进行RT-PCR技术检测各组细胞凋亡因子Caspase-3 mRNA的表达。第二部分，以2mmol/LSTZ及300μmol/LH2O2诱导胰岛NIT-1细胞凋亡，Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪技术凋亡各组细胞的凋亡率，CellROX流式细胞仪技术检测各组细胞活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS）的含量，逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测各组细胞AT1、Caspase-3、NADPH mRNA的表达。
　　结果:第一部分胞内胞外胰岛NIT-1细胞氧化应激损伤模型各组细胞实验结果:①Hochest33342荧光染色下各组细胞在荧光显微镜下细胞形态的描述:F组细胞的弥漫均匀淡蓝色荧光，细胞形态较规则，多数细胞胞膜完整，A组细胞着色与细胞形态大致与F组相近，B组可见部分细胞细胞核成亮蓝色荧光，胞核浓缩，细胞形态大小不一，C组和E组细胞荧光亮度不均一、细胞形态不规则、胞膜不完整，细胞碎片较多。D组细胞部分细胞成强蓝色荧光，并见细胞形态大小不一，有细胞碎片。②Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率结果:A、B、C、D、E5组细胞凋亡率与F组比较，A、B、C、D、E5组细胞凋亡率显著升高P＜0.05。③RT-PCR技术检测B组D组及F组细胞Caspase-3的相对表达量结果:与F组比较，B组和D组的胰岛NIT-1细胞Caspase-3增高(P＜0.05)。第二部分厄贝沙坦对STZ及H2O2诱导胰岛NIT-1细胞凋亡的影响实验结果:①Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡率:G1、G2、G3组的细胞凋亡率均少于G4组(P＜0.05)，H1、H2、H3组的细胞凋亡率少于H4组，且细胞凋亡率随着厄贝沙坦浓度的增加及培养时间的延长而逐渐减少。②CellROX流式细胞仪技术检测各组细胞ROS相对含量的表达:G1、G2、G3组的细胞ROS相对含量均低于G4组(P＜0.05)，H1、H2、H3组的ROS相对含量低于H4组(P＜0.05)，且细胞ROS的相对含量也随着厄贝沙坦浓度的增加及培养时间的延长而逐渐减少。③RT-PCR技术检测各组细胞基因的相对表达量结果:G1、G2、G3组的细胞ROS相对含量均少于G4组(P＜0.05)，H1、H2、H3组的ROS相对含量低于H4组(P＜0.05)，厄贝沙坦组的Caspase-3、NADPH mRNA的表达量下降(P＜0.05)，AT1 mRNA的表达量也呈下降趋势(P＜0.05)。
　　结论:1、一定浓度的STZ及H2O2作用于胰岛NIT-1细胞30min可以造成胰岛NIT-1细胞损伤。2、厄贝沙坦通过降低胰岛NIT-1细胞的凋亡率、抑制ROS的产生、下调Caspase-3、NADPH、AT1 mRNA的表达，对胰岛NIT-1细胞产生一定的保护作用，但厄贝沙坦的保护作用是否与抑制AT1受体有关有待进一步的研究。

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摘要

第一部分 建立胞内胞外胰岛NIT-1细胞损伤模型

前言

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 厄贝沙坦对氧化应激损伤的胰岛NIT-1细胞的影响

前言

2．1 材料

2．2 方法

结果

讨论

结论

参考文献

英文缩略词表

综述 ARB类药物与氧化应激引起的胰岛细胞凋亡

致谢