心肌细胞胞内钙信号研究：胞外钙、β受体激动剂及阻滞剂的影响

摘要

前言：
　　Ca2+作为细胞内最广泛和最重要的第二信使之一,在心肌细胞的兴奋-收缩耦联、物质代谢、细胞周期调控与细胞间通信等活动中发挥重要作用。心肌细胞胞内[Ca2+]信号的研究是探索心脏疾病病理生理机制的重要课题之一。鉴于[Ca i2+]在生物学上的重要性,研究者建立了多种在细胞和(或)亚细胞水平上对[Ca i2+]活动机制进行观测的方法和技术:如单光子和双光子共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜、宽视野显微镜和低噪CCD照相机的联用等。近十几年来,随着激光共聚焦显微镜技术的发展及钙离子荧光指示剂的更新,其精确性及高分辨率等特征大大提高了人们对心肌胞内Ca i2+信号分子的影像观测及三维重组能力;这为功能学研究提供了方便直观的活的细胞Ca2+信号图像,从而人们对细胞内钙信号图像特征及调控机制的认识进一步深入。
　　在本研究中,我们采用LSM510 META型激光共聚焦显微镜,在快速面扫描和线扫描模式下记录胞外低Ca2+、胞外高Ca2+及β受体激动剂异丙肾上腺素(Isoproterenol, ISO)、阻滞剂普萘洛尔(Propranolol, pro)对心室肌细胞静息钙水平(resting[Ca2+])的改变及电场刺激诱发的钙瞬变的影响效应并分析其机制,探讨了胞内钙信号与心肌细胞功能活动(产生钙瞬变和收缩的能力)的关系和变化规律。希望为临床心血管疾病的治疗或防治提供一定的理论依据。i
　　目的：
　　1.建立激光共聚焦显微镜下心肌胞内钙信号研究模型及方法。
　　2.应用激光共聚焦显微镜成像技术研究胞外低Ca2+及高Ca2+环境对心肌胞内钙信号的影响及其机制。
　　3.应用激光共聚焦显微镜成像技术研究β受体激动剂及阻滞剂对心肌胞内钙信号的影响。
　　材料和方法：
　　选用体重200~300g的成年SD大鼠,使用改良的Langendorff装置,以胶原酶+蛋白酶主动脉逆向灌流法急性分离心室肌单细胞,经过三步梯度复钙法复钙,静置1~2h后与荧光指示剂Fluo4-AM孵育染色;置于Zeiss LSM510-META型倒置激光共聚焦显微镜下,由NEC-7203型电子刺激器提供同步阈上电场刺激心肌细胞产生兴奋,诱发胞内钙瞬变;胞内钙信号图像由共聚焦系统实时记录。有关药物通过自制多管道给药系统灌流供给;主要观测不同浓度胞外钙(分别含0.0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol\L Ca2+)、不同浓度β受体激动剂(分别含0.1、0.2、0.5、1.0μmol\L ISO)、β受体激动剂及阻滞剂(1.0μmol\L ISO+4.0μmol\L propranolol)对心肌胞内钙信号(静息钙水平和诱发钙瞬变)的作用。实验设计为自身前后对照。钙信号图象数据的处理及分析使用自编的图像分析处理程序,编程语言为IDL6.2(Research Systems,Inc.,Boulder,CO)。胞内静息钙水平以荧光强度F0表示。而诱发钙瞬变以标准荧光强度(normalized fluorescence)的净变化即?F/F0表示,其中F0表示静息状态的荧光强度。
　　结果：
　　1.采用本科室改进的Langendorff法急性分离的SD大鼠心肌细胞,约有85％-95%的细胞形态呈长杆状,可得40%~60%钙稳态心肌细胞;与钙荧光染料Fluo4-AM孵育后给予阈上场刺激,在共聚焦显微镜下可记录到典型的钙瞬变图像。
　　2.胞外低钙对心肌胞内钙信号的影响:
　　在本研究中,胞外正常灌流液含钙1mM。当胞外钙浓度逐渐变为0.5mM时,发现有3/7诱发钙瞬变变化不明显,2/7诱发钙瞬变明显增强,另有2/7诱发钙瞬变有所减弱;多数(6/7)诱发钙瞬变的时程(从上升相的半高峰处到下降相的半高峰处所持续的时间)有所延长,钙瞬变前沿不整齐现象不明显。当胞外钙浓度逐渐变为0.2mM时,诱发钙瞬变有所增强的约有40%(2/5),其余的变化不明显;所有诱发钙瞬变的时程均延长( P<0.05)*(由正常灌流液的222.5+/-36.9ms变为0.2mM时的247.4+/-37.9ms),钙瞬变前沿均变得不整齐(因为刚开始时有些部位钙内流太弱,不足以触发胞内钙释放;后因为临近部位钙信号的增强,循钙诱导钙释放的原则而引起全细胞范围的钙释放)。当胞外钙浓度逐渐变为0.1mM时,约有一半(3/6)的细胞的诱发钙瞬变明显逐渐减弱,但最终并未完全消失;另有一半(3/6)细胞在灌流开始不久时钙瞬变有所增强且时程延长。当胞外钙浓度逐渐变为0.05mM时,可见开始时诱发钙瞬变有所增强,之后逐渐减弱,但最终胞内仍可见场刺激引起的微弱钙信号存在(10/10)。当胞外钙浓度逐渐变为0mM(无钙台式液)时,心肌细胞的诱发钙瞬变均逐渐减弱,并最终消失(5/5)。
　　总之,随胞外钙浓度从正常情况下的1mM最终降至0mM的过程中,给予心肌细胞阈上场刺激,一般的变化过程是:刚开始(灌流约1分钟时)仍可诱发钙瞬变和细胞收缩,且诱发钙瞬变强度有增强趋势,后诱发钙瞬变前沿变得不整齐;随胞外钙继续降低,诱发钙瞬变减弱且不连续(有些部位有胞内钙释放,有些部位没有),再往后胞内钙释放逐渐不明显,再往后则只有少量胞外钙内流而无胞内钙被触发释放;当胞外钙浓度为0mM时,诱发钙瞬变消失,心肌细胞失去收缩能力。
　　3.胞外高钙对心肌胞内钙信号的影响:
　　当胞外钙浓度由1mM逐渐变为2mM时,胞内静息钙水平(荧光强度)处理前后没有明显差异;诱发钙瞬变峰值(?F/F0)差别也无统计学意义也。当胞外钙浓度由1mM逐渐变为5mM时,胞内静息钙水平改变处理前后有明显差异( P<0.05);诱发钙瞬变峰值(?F/F0)灌流后峰值明显降低( P<0.05)。当胞外钙浓度由1mM逐渐变为10mM时,胞内静息钙水平处理前后有明显差异( P<0.05),且高于胞外钙浓度为5mM时的静息钙水平( P<0.05);诱发钙瞬变峰值(?F/F0)灌流后峰值明显降低( P<0.05),且低于胞外钙浓度为5mM时的峰值( P<0.05)。4.β受体激动剂及阻滞剂对心肌胞内钙信号的效应:
　　当ISO为0.1μM时,胞内静息钙水平下降,灌流0.1μM ISO后胞内静息钙水平降低( P<0.05);灌流0.1μM ISO后心肌细胞的诱发钙瞬变峰值(?F/F0)升高,前后相对比值为1.24±0.07,可见灌流0.1μM ISO后心肌细胞的诱发钙瞬变峰值显著增大( P<0.01)。当ISO为0.2μM时,胞内静息钙水平也下降,灌流0.2μM ISO后胞内静息钙水平降低( P<0.05);灌流0.2μM ISO后心肌细胞的诱发钙瞬变峰值升高明显,心肌细胞的诱发钙瞬变峰值显著增大( P<0.01)。当ISO为0.5μM时,胞内静息钙水平降低( P<0.05),心肌细胞的诱发钙瞬变峰值显著增大( P<0.01)。当胞外ISO为1.0μM时,胞内静息钙水平降低( P<0.05),诱发钙瞬变峰值增大( P<0.05)。
　　在另一组实验中,胞内静息钙水平由正常时的12.18±1.04降为1.0μM ISO时的10.53±0.90,再加入4.0μM Propranolol(β-受体阻断剂)后静息钙水平升高至11.62±1.11,洗去胞外ISO及Propranolol后静息钙水平为12.94±1.47(n=7);可见ISO对胞内静息钙水平的降低作用可被其阻断剂Propranolol所阻断( P<0.05);灌流1.0μM ISO后心肌细胞的诱发钙瞬变峰值由正常时的8.40±0.69增强为10.82±0.77,加入4.0μM Propranolol后诱发钙瞬变峰值为7.70±0.43;洗去胞外ISO及Propranolol后诱发钙瞬变峰值为7.17±0.79;,可见ISO对诱发钙瞬变峰值的增强作用也可被其阻断剂Propranolol所阻断( P<0.05)。
　　结论：
　　1.成功建立了激光共聚焦显微镜下心肌胞内钙信号研究模型与方法,获得了一系列胞内钙信号图像,为完整心肌细胞钙信号数字化图谱的有机组成部分。
　　2.胞外低钙环境下诱发钙瞬变幅度下降,但时程延长,并有兴奋-收缩脱耦联发生。
　　3.胞外高钙环境下心肌细胞内静息钙离子荧光信号强度增强提示细胞钙稳定性下降及钙超载;随胞外钙浓度增大诱发钙瞬变相对峰值减小,兴奋-收缩耦联效率降低;并且,前者显然是后者的重要原因。
　　4.较低浓度(0.1μM)的β受体激动剂异丙肾上腺素(ISO)即可使胞内静息钙信号水平显著下降,而诱发钙瞬变峰值明显增大;且ISO的这种效应可被其阻断剂普萘洛尔完全阻断。

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前言

第一章 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

1.1.2 主要仪器和设备

1.1.3主要试剂

1.1.4 溶液组成及配制

1.1.5 细胞分离方法及步骤

1.1.6 仪器设置

1.2 方法

1.2.1 Ca2+作用下静息[Ca2+]i及诱发钙瞬变图像测定

1.2.2 胞外低钙、高钙液及ISO、Propranolol药物灌流

1.2.3 图像数据处理与分析

1.2.4 统计学方法

第二章 结果与讨论

第一部分 成年SD大鼠心肌细胞标本制备及其[Ca2+]i测定

1.1 结果

1.2 讨论

第二部分 胞外高Ca2+及低Ca2+对心肌胞内钙信号的影响

2.1 结果

2.2 讨论

第三部分 β受体激动剂及阻滞剂对心肌胞内钙信号的影响

3.1 结果

3.2 讨论

结论

参考文献

综述

研究生期间发表论文及专利

致谢