S1P1受体调节剂对放射引起的小肠干细胞损伤及免疫炎症反应的调节作用研究

摘要

小肠绒毛是机体内增殖最活跃的组织之一，小肠粘膜上皮细胞终身在不断地自我更新，这一过程依赖小肠隐窝中的干细胞的持续增殖、分化取代外层的终末分化细胞来完成。当照射剂量<8Gy,隐窝细胞出现凋亡，照射剂量＞14Gy，隐窝细胞消失，绒毛出现脱落。因此胃肠的放射损伤及恢复程度与隐窝细胞或者干细胞的损伤、再生密切相关。
　　小肠干细胞分子表面标志的研究进展缓慢，一直制约着对小肠干细胞调控及胃肠损伤机制的研究。直到近几年来，利用基因小鼠模型和谱系追踪技术，才成功的鉴定到了多种小肠干细胞的分子表面标志，确定了小肠干细胞的位置和分群。目前鉴定的小肠干细胞主要分为2类，一类为静息干细胞，主要位于小肠隐窝基底部+4位，表面标志包括Bmi1，mTert，Hopx及Lrig1等，另一类为Lgr5标记的循环干细胞。其中，lgr5循环干细胞对辐射敏感，而辐射耐受的静息干细胞可在激活后补充循环干细胞和快速增殖的TA细胞。
　　前期我们的研究结果表明，S1P1受体调节剂对小肠隐窝细胞有明显的保护作用。S1P1是磷脂类分子S1P的的G蛋白偶联受体，主要分布在血管内皮细胞和淋巴细胞上。在维持血管通透性和完整性、淋巴细胞发育和循环上有重要的作用。因此本实验第一部分主要应用带有小肠干细胞特征标志的模式动物，如Lgr5tml(cre/ERT2)小鼠、Bmi1tml(cre/ERT)小鼠等，研究Lgr5标记的连续分裂ISCs和Bmi1标记的静态ISCs放射损伤特点，研究S1P1受体调节剂对放射后小肠干细胞组织重建的调控作用。首先我们培育并鉴定Lgr5tml(cre/ERT2);Gt(ROSA)26Sortml(smo/EYFP)和Bmi1 tml(cre/ERT);Gt(ROSA)26Sortml(smo/EYFP)小鼠，然后通过他莫西芬诱导并在诱导后5d观察到荧光细胞从隐窝开始向绒毛顶尖处移动，由此建立了小肠干细胞分析检测方法。其次通过不同照射剂量的摸索观察放射对小肠干细胞的影响，发现在10Gy腹部照射和12Gy全身照射下，可观察到小肠干细胞在照射后从消失到再生的过程。随后研究了S1P1受体调节剂对不同照射剂量下小肠干细胞组织重建的调控作用，发现S1P1受体调节剂CYM5442对16Gy高剂量局部照射小鼠没有明显的治疗作用;在15Gy全身照射后3.5d CYM5442并不能有效的增加Lgr5+细胞的数量，但能有效的促进隐窝细胞的增殖。我们通过分离不同肠道组织（十二指肠、空肠、回肠、结肠），发现10Gy和12Gy全身照射下S1P1受体激动剂CYM5442能在照射后3.5d和7d提高各个肠段组织再生隐窝的数量。应用qPCR的方法检测了15Gy照射后干细胞相关基因(Lgr5、olfm4、mTert、Hopx、Lrig1、Bmi1、Ascl2)的表达，发现S1P1受体调节剂CYM5442在照后6h显著提高这些基因的表达、照后1d对mTert、Bmi1等+4位基因依然有着提高的作用，照后3.5d对于细胞相关基因则影响不大。
　　小肠粘膜在辐射诱导的免疫炎性反应中是高敏感的器官。小肠在受到放射损伤后会产生大量的细胞因子。因此在第二部分实验中我们应用流式细胞分析等技术重点观察天然免疫细胞如中性粒细胞、单核-巨噬细胞等在照后不同时间的变化，分析炎症免疫细胞浸润与放射损伤发生、发展的关系，并研究S1P1受体调节剂对炎性反应的调控作用。我们通过分离小鼠小肠固有层细胞，发现在15Gy全身照射后24h和48h，S1P1受体调节剂CYM5442能显著减少中性粒细胞的数量，但对其它类型的细胞群体没有影响。随后用qPCR的方法检测了15Gy照射后炎性因子相关基因（白介素类IL-1b、IL-6、IL-10、IL-12b，趋化因子Cc12、Cc15、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl10，粘附分子Icam1、Vcam1)的表达，发现S1P1受体调节剂CYM5442在照射后6h抑制白介素类和趋化因子，提高粘附分子的表达。照射后1d反而提高白介素类和趋化因子，抑制粘附分子。照射后3.5d则对这些基因影响不大。
　　我们通过S1P1受体调节剂对小肠干细胞组织功能重建机制以及放射引起的肠道组织炎性反应的研究，可以更好的揭示急性放射病发病新机制，同时也为基于靶点的抗放药物设计提供了基础。

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缩略语表

摘要

前言

第一章 S1P1受体调节剂对放射后小肠干细胞组织重建的调控作用

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

1．3 仪器与耗材

2 实验方法

2．1 Lgr5tm1(cre/ERT2)；Gt(ROSA)26Sortm1(Smo/EYFP)和Bmi1tm1(cre/ERT)；Gt(ROSA)26Sortm1(Smo／EYFP)小鼠基因型的鉴定

2．2 利用Lgr5tm1(cre／ERT2)；Gt(ROSA)26Sortm1(smo/EYFP)小鼠建立小鼠小肠干细胞分析检测方法

2．3 应用Lgr5、Bmi1干细胞分子标志小鼠观察放射对小肠干细胞损伤的影响

2．4 S1P1受体调节剂对不同剂量照射的小鼠小肠干细胞的损伤及组织重建的影响

2．5 S1P1受体调节剂对15Gy照射后小鼠小肠干细胞相关标志基因表达的影响

3 实验结果

3．1 Lgr5tm1(cre/ERT2)；Gt(ROSA)26Sortm1(Smo/EYFP)和Bmi1tm1(cre/ERT)；Gt(ROSA)26Sortm1(smo/EYFP)小鼠基因型的鉴定

3．2 利用 Lgr5tm1(cre/ERT2)；Gt(ROSA)26Sortm1(Smo/EYFP)小鼠建立小鼠小肠干细胞分析检测方法

3．3 应用Lgr5、Bmi1千细胞分子标志小鼠观察放射对小肠干细胞损伤的影响

3．4 S1P1受体调节剂对不同剂量照射的小鼠小肠干细胞的损伤及组织重建的影响

3．5 S1P1受体激动剂对15Gy全身照射后小肠干细胞相关标志基因表达的影响

4 讨论

第二章 S1P1受体调节剂对放射引起的炎性反应的调节作用

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

1．3 仪器与耗材

2 实验方法

2．1 利用流式细胞仪建立小肠固有层细胞分析检测方法

2．2 15Gy全身照射对小鼠小肠固有层细胞的影响

2．3 S1P1受体调节剂对15Gy全身照射小鼠照后不同时间点小肠固有层免疫炎性细胞浸润的影响

2．4 S1P1受体调节剂CYM5442对15Gy照射后小肠炎性细胞相关基因表达的影响

3 实验结果

3．1 利用流式细胞仪建立小肠固有层细胞分析检测方法

3．2 15Gy全身照射对小鼠小肠固有层细胞的影响

3．3 S1P1受体调节剂对15Gy全身照射小鼠照后不同时间点小肠固有层免疫炎性细胞浸润的影响

3．4 S1P1受体调节剂CYM5442对15Gy照射后小肠炎性细胞相关基因表达的影响

四 讨论

参考文献

小肠干细胞表面标志基因的研究进展

致谢

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