调控Toll样受体2核转录因子-κB信号通路对大鼠呼吸机相关性肺损伤的影响

摘要

目的:探讨TLR2单克隆抗体预处理后，Toll样受体2/核转录因子-κB(TLR2/NF-κB)信号通路对呼吸机相关性肺损伤(VILI)的影响。
　　方法:分体内实验和体外实验两部分。将60只雄性SD大鼠按随机数字表法分为6组，每组10只。体内实验:A组:8ml/kg VT行机械通气;B组:经气管导管缓慢滴入25ug/ml浓度的TLR2mAb(10ug/kg)干预后，40ml/kg潮气量(VT)行机械通气; C组:滴入相同量生理盐水干预后，40ml/kg VT行机械通气。各组于通气4h后提取大鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织。体外部分:D组大鼠行8ml/kg VT机械通气4h后提取肺泡巨噬细胞培养，E、F组大鼠行40ml/kg VT机械通气4h后提取肺泡巨噬细胞培养。D组:正常对照组，给予相同量PBS干预及刺激;E组:给予25ug/ml TLR2mAb干预，1h后给予TNF-α刺激因子;F组:给予PBS干预，1h后给予TNF-α刺激因子。三组细胞培养16h后分别收集细胞和细胞培养液。检测方法包括计算肺组织干湿比重(W/D)，镜下观察肺组织病理学及细胞超微结构改变;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液、血清和BALF中白介素（IL-1β、IL-6）、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)分别检测肺组织和肺泡巨噬细胞TLR2、NF-κB、MyD88 mRNA及蛋白的表达。
　　结果:显微镜下观察显示:A、B组肺组织无明显病理学改变，肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞超微结构无明显损伤;C组可见明显肺泡腔融合，肺间隔增宽，大量炎性细胞聚集，肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞细胞膜破坏，胞质大量空泡化，细胞器破坏严重，细胞核固缩，核周隙明显增宽。A、B组W/D比值及血清和BALF中炎性细胞因子水平均较C组明显降低，差别有统计学意义（P≤0.05);D、E组细胞培养液中炎性细胞因子水平较F组明显降低，差异有统计学意义（P≤0.05)。A、B组肺组织TLR2、NF-κB、MyD88 mRNA及蛋白表达均明显低于C组;D、E组肺泡巨噬细胞上述因子的mRNA及蛋白表达均明显低于F组，差异有统计学意义（P≤0.05)。
　　结论:TLR2-mAb预处理通过阻断TLR2/NF-κB信号通路可减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠炎症因子的释放，在一定程度上减轻VILI。

目录

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个人简历

主要英文及缩略词

摘要

前言

第一章 实验材料

1、主要实验仪器

2、主要实验试剂

第二章 实验方法

1、动物来源及实验分组

2、体内动物模型的建立

3、体外动物模型建立及巨噬细胞分离提取

4、纳入大鼠标准

5、体内实验标本的采集和处理

6、体外实验巨噬细胞的培养及干预

7、体外实验标本的收集

8 肺组织湿干比重(W／D)的检测

9、透射电镜观察肺泡超微结构

10、HE染色观察肺组织大体形态

11、血清、BALF、培养上清中TNF-α、IL-10、IL-6的检测

12、肺组织、肺泡巨噬细胞总RNA的提取

13、肺组织、肺泡巨噬细胞中TLR2、NF-κB、MyD88 mRNA的检测

14、肺组织、肺泡巨噬细胞总蛋白的提取与浓度检测

15、肺组织、肺泡巨噬细胞中TLR2、NF-κB、MyD88蛋白的检测

16、统计学处理

第三章 结果

1、各组肺组织湿干比重(W／D)的比较

2、各组肺组织的大体形态

3、肺泡各种细胞电镜下超微结构

4、血清、BALF和细胞培养上清中炎性因子的表达

5、WB检测TLR2、NF-κB、MyD88蛋白的表达

6．肺组织、肺泡巨噬细胞目的基因的表达

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 TLR2信号通路与炎症反应

攻读硕士学位期间发表论文

致谢