基于耐药和单细胞全克隆构建肝癌干细胞体外富集模式的实验研究

摘要

背景：肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是指在肿瘤组织中，极少量具有以无限的自我更新潜能及真正的致瘤能力为最重要特征的肿瘤细胞的群体。肝癌我国最常见的恶性肿瘤，恶性度极高且病情进展很快，其发病人数也已占到全世界病例的40％，故被列入预防治疗的重点疾病。如何才能积极有效的分离纯化出肝癌干细胞，一直是学术界着眼及研究的重点热点，本课题组选取了HepG2细胞株为研究对象，其来源于高加索地区一个15岁白人的肝癌组织，来源的肝癌组织类型为肝母细胞瘤，因可能是最早分离得到且背景清晰、表型性状稳定等优点，已成为被广泛使用的肝细胞系而应用于肝癌研究的领域内。根据单个细胞全克隆富集方法的优势结合临床广谱抗肿瘤化疗药物阿霉素进行细胞毒性干预，将获得的全克隆肝癌细胞经异种移植实验检测其成瘤性，从而试图建立一种单细胞全克隆加阿霉素干预的改良型肝癌干细胞富集模式。研究发现：单个细胞有效稀释克隆培养法得到的全克隆细胞在裸鼠体内成瘤率达到100%，而在不同浓度阿霉素干预模式下的单个细胞克隆培养，所得到的全克隆比率不尽相同且裸鼠体内成瘤率也有较大差异。研究表明经单个细胞全克隆加阿霉素干预的培养方法较大可能的成为一种新的改良型肝癌干细胞富集模式。
　　目的：观察人肝母细胞瘤HepG2单个细胞培养形成的三种克隆及阿霉素干预下全克隆裸鼠体内成瘤情况，探讨基于肿瘤干细胞耐药特性和体外单细胞培养形成全克隆现象，建立一种简单易行的肝癌干细胞体外富集模式。
　　方法:选择人肝母细胞瘤HepG2细胞系，以有限稀释法建立体外单细胞克隆培养体系，进行以下两部分实验：1.先观察体外单细胞克隆培养的克隆细胞生长曲线和形成全克隆、部分克隆以及旁克隆等三类克隆比例后，选取全克隆逐级扩增，最后取106的HepG2细胞进行裸鼠皮下荷瘤实验。2.阿霉素干预HepG2癌细胞克隆的实验模式：⑴.先加0.1μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL梯度浓度的阿霉素干预HepG2细胞48hrs，单个细胞克隆培养后形成的全克隆、部分克隆及旁克隆进行逐级扩增和裸鼠荷瘤实验。⑵.先进行单细胞克隆培养，然后只针对全克隆细胞加0.5μg/mL、0.3μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL梯度浓度的阿霉素干预48hrs，观察全克隆生长情况,对于干预后存活的全克隆全部进行逐级扩增和裸鼠荷瘤实验。
　　结果：1. HepG2细胞单细胞培养可形成全克隆、部分克隆和旁克隆等三种癌细胞扩增生长模式，总克隆形成率为(32.78±9.03)%，其中克隆构成为全克隆(7.12±2.96)%、部分克隆(62.67±13.39)%、旁克隆百分比(30.21±14.87)%；所有全克隆均可逐级扩增，且在106细胞水平裸鼠成瘤率为100%（8/8）。2.⑴单细胞克隆培养前进行阿霉素干预，发现仅0.05μg/mL和0.01μg/mL组的全克隆存活，并可逐级扩增培养和100%（3/3、8/8）成瘤。⑵单细胞克隆培养后的全克隆进行阿霉素干预，发现仅0.1μg/mL、0.05μg/mL和0.01μg/mL组全克隆存活，并可逐级扩增培养和100%（5/5、5/5、5/5）成瘤。
　　结论：HepG2细胞体外单细胞培养的全克隆样生长且耐受阿霉素杀伤的细胞群体，极有可能是富含肝癌干细胞，这可能是简单有效体外肿瘤干细胞富集模式。

目录

封面

声明

个人简历

目录

中文摘要

英文摘要

实验流程图

前言

第一部分人肝母细胞瘤细胞HepG2单细胞培养及全克隆扩增裸鼠皮下荷瘤实验研究

1 材料与方法

2.统计学处理

3.实验结果

第二部分 阿霉素干预人肝母细胞瘤HepG2细胞克隆的实验研究

1 材料与方法

2.统计学处理

3.实验结果

讨论

参考文献

结论

综述:有关肿瘤干细胞假说的几点争辩

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文