基于MAPK基因沉默和TMT标记联合LC-MS/MS技术研究雌二醇作用Ishikawa细胞的影响

摘要

第一部分慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响
　　1、慢病毒shRNA载体构建并建立稳定转染的Ishikawa细胞株
　　[目的]本课题组前期发现雌二醇可以通过MAPK信号通路促进子宫内膜癌细胞的发生发展，为明确MAPK信号通路对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的相关机制，我们利用RNAi沉默子宫内膜癌细胞Ishikawa中的MAPK基因，并筛选稳定表达的细胞株，为探究MAPK基因低表达对雌二醇作用子宫内膜癌细胞的影响奠定基础。
　　[方法]
　　(1)设计合成4组特异性针对MAPK基因的siRNA，构建shRNA质粒载体，感染Ishikawa细胞。
　　(2)利用RT-PCR和Western blot实验检测各组对目的基因的抑制效果，筛选出沉默效果最佳的靶点。
　　(3)将选取的最佳靶点包装成慢病毒shRNA载体，感染Ishikawa细胞。
　　(4)将感染目的基因的细胞Ishikawa，经流式分选获得稳定的细胞株，采用RT-PCR和Western blot实验检测各组对目的基因的抑制效果。
　　[结果]
　　(1)RT-PCR和Western blot筛选出最佳干扰靶点，siRNA序列为:GGACTGTCTCTGGTAGAGATGGCGGTTGG
　　(2)测序证实:运用特异性针对MAPK基因的siRNA，成功构建了慢病毒shRNA载体，包装滴度为3×108 TU/ml。感染Ishikawa细胞后，荧光倒置显微镜观察及流式细胞仪检测，显示各组感染效率均在90％以上，病毒感染成功。
　　(3)流式细胞仪分选后，RT-PCR和Western blot验证干扰效率，获得稳定转染的细胞株。
　　[结论]RNA干扰技术可有效抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中的MAPK基因表达，为后续实验奠定基础。
　　2、慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响
　　[目的]利用RNA干扰技术抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa中MAPK基因的表达，检测MAPK基因低表达对雌二醇作用Ishikawa细胞后相关基因、蛋白的影响，及对细胞存活能力、周期、凋亡影响，探究MAPK基因低表达对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响及潜在机制。
　　[方法]课题组前期研究发现:应用10-6mol/L雌激素刺激细胞30min效果最佳。实验分四组:(1)Control组:无雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(2)Ishikawa细胞组:经10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(3)NC组:经10-6mol/L雌二醇刺激转染阴性慢病毒的Ishikawa细胞;(4)MAPK组:经10-6mol/L雌二醇刺激前期构建的MAPK-RNAi细胞。
　　(1)RT-PCR和Western blot实验检测雌二醇作用四组细胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表达。
　　(2)MTT实验检测四组细胞生长情况，分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞生存率的影响。
　　(3)细胞迁移实验Transwell检测四组细胞体外迁移能力，分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞体外迁移能力的影响。
　　(4)流式细胞仪检测四组细胞周期及凋亡率变化，分析MAPK基因沉默前后对Ishikawa细胞周期及凋亡的影响。
　　[结果]
　　(1)Ishikawa组VEGF、bFGF基因及蛋白表达明显增加，与对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05);NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p＞0.05); MAPK组VEGF、bFGF基因及蛋白表达明显减少，与shikawa组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　(2)MTT结果显示:Ishikawa组细胞倍增时间明显加快，与对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05);NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p＞0.05); MAPK组细胞倍增时间明显延长，与shikawa组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　(3)迁移结果显示:Ishikawa组穿过微孔的细胞数明显增加，与对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05); NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p＞0.05); MAPK组穿过微孔的细胞数明显减少，与shikawa组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　(4)细胞凋亡结果显示:Ishikawa组细胞总凋亡率(％)明显下降，与对照组相比差异有统计学意义(p＜0.05);NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p＞0.05); MAPK组细胞中晚期凋亡率、总凋亡率(％)均明显增加，与shikawa组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　(5)细胞周期结果显示:Ishikawa组细胞G0/G1期比率明显下降，与对照组相比差异有统计学意义(p＞0.05); NC组与Ishikawa组相比差异无统计学意义(p＞0.05); MAPK组细胞G0/G1期明显增加，S期和G2期减少，与shikawa组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　[结论]MAPK基因低表达可以干扰E2在基因及蛋白水平激活子宫内膜癌细胞产生VEGF、bFGF，可以下调E2对子宫内膜癌细胞增殖的促进作用和凋亡的抑制作用。
　　3、构建MAPK基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型
　　[目的]构建MAPK基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型，观察MAPK基因低表达对子宫内膜癌裸鼠移植瘤生长的影响，探究MAPK基因能否成为子宫内膜癌基因治疗的分子靶点。
　　[方法]将BALB/C裸鼠随机分为3组，每组6只。实验分组:(1) Ishikawa组:经10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(2)NC组:经10-6mol/L雌二醇刺激转染阴性慢病毒的Ishikawa细胞;(3) MAPK组:经10-6mol/L雌二醇刺激的MAPK-RNAi细胞。
　　将细胞分别接种于裸鼠右侧背部。观察移植瘤成瘤情况及肿瘤生长情况，成瘤后，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)。按照肿瘤体积计算公式:V=0.5×a×b2来计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。应用WesternBlot检测各组MAPK信号通路相关蛋白的表达。
　　[结果]成功构建子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型。MAPK组裸鼠移植瘤增长速度明显减慢、瘤体重量减少、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表达明显降低，与Ishikawa组、NC组相比差异有统计学意义(p＜0.05);而Ishikawa组移植瘤增长速度、瘤体重量、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表达，与NC组相比差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　[结论]MAPK基因低表达抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长，提示MAPK基因有可能成为子宫内膜癌基因治疗的分子靶点。
　　第二部分基于TMT标记联合LC-MS/MS技术筛选雌激素作用Ishikawa细胞后的差异蛋白研究
　　[目的]使用TMT定量蛋白组学技术研究雌激素作用子宫内膜癌细胞Ishikawa后差异表达的蛋白质，寻找与子宫内膜癌相关的诊断标志物及探索子宫内膜癌的发病机制。
　　[方法]实验分2组:(1))Control组:无雌二醇刺激的Ishikawa细胞;(2)雌激素组:经10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa细胞。
　　本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，采用基于TMT的蛋白组学技术分析不同分组的Ishikawa细胞差异蛋白，选取差异表达的蛋白质进行液相色谱仪联合质谱分析，借助生物信息学方法筛选出有重要价值的蛋白质，Mascot软件搜索Uniprot数据库鉴定差异蛋白质，采用In Cell ELISA技术验证其表达的规律。
　　[结果]
　　(1)经TMT定量蛋白组学分析，共筛选出92个差异蛋白，其中上调蛋白80个，下调蛋白12个;
　　(2)差异蛋白的亚细胞定位主要集中在细胞核上;
　　(3)差异蛋白主要参与10条代谢通路代谢通路，主要是mTOR信号通路（参与蛋白:RPS6KA1）、RNA transport通路（参与蛋白:NCBP1;RPP30;EIF3B;Pinin;ACIN1)及mRNA surveillance pathway通路(参与蛋白:NCBP1; Pinin; ACIN1);
　　(4)使用生物信息学方法对这92个差异蛋白进行全面分析，并采用InCell ELISA技术对差异蛋白RPS6KA1进行验证，表达趋势与质谱一致。
　　[结论]
　　(1)本研究证明基于TMT标记联合LC-MS/MS技术可作为鉴定筛选子宫内膜癌差异蛋白的有效方法;
　　(2)雌激素组蛋白RPS6KA1表达明显增加，推测雌激素可以通过mTOR信号通路影响子宫内膜癌的发生发展。

目录

声明

个人简历

主要缩略词

摘要

前言

一 慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用人子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响

第一部分 慢病毒shRNA载体构建并建立稳定转染的Ishikawa细胞株

1 细胞、质粒与菌株

2 主要试剂和仪器

3 实验方法

4．实验结果

5 讨论

第二部分 慢病毒介导的MAPK基因沉默对雌二醇作用子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外影响

1 细胞株

2 试剂

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

第三部分 构建MAPK基因低表达Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型

1 细胞株及实验动物

2 试剂和仪器

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

二 基于TMT标记联合LC-MS／MS技术筛选雌激素作用Ishikawa细胞后的差异蛋白研究

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 MAPK信号传导通路及蛋白质组学与肿瘤的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文