铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的耐药变迁及差异蛋白组学和比较基因组学研究

摘要

目的：
　　1.观察2013-2015年广西医科大学第一附属医院铜绿假单胞菌临床菌株对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的药敏变迁情况。
　　2.了解铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药前后的全菌体蛋白组变化，并筛选出差异蛋白，从蛋白组学角度了解铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的耐药基础。
　　3.了解铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药前后的基因组学变化，并找出突变位点，进行生物信息学分析，从基因组学角度进一步明确铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药的分子基础。
　　方法：
　　1.收集2013-2015年广西医科大学第一附属医院检验科细菌室培养出的全部铜绿假单胞菌的相关信息，分析3年间铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的药敏情况，并对检出量较大的临床科室的铜绿假单胞菌进行亚组分析，了解相关病区铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的药敏变迁。
　　2.采用亚抑菌浓度（1/2最小抑菌浓度）梯度递增法体外诱导PAO1对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药，并设置同步对照组，制备实验组（3株）和同步对照组（3株）菌株的全菌体蛋白溶液，运用SELDI技术检测铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药前后全菌体蛋白谱，并使用配套软件筛选出差异蛋白。
　　3.提取实验组（3株）和同步对照组（3株）菌株的基因组DNA，对抽提的DNA样本进行碱基测序，将实验组和对照组菌株的碱基序列与NCBI发表的PAO1标准菌株基因序列进行比对，找出有意义的突变位点，进行生物信息学分析。
　　结果:
　　1.广西医科大学第一附属医院检验科细菌室2013年对培养出的1306株铜绿假单胞菌进行了药敏试验，其对头孢哌酮钠/舒巴坦钠敏感情况分别为敏感52.4％（684/1306），中敏26.4%（345/1306），耐药21.2%（345/1306）；2014年对培养出的1149株铜绿假单胞菌进行了药敏试验，其对头孢哌酮钠/舒巴坦钠敏感情况分别为敏感54.0%（621/1149），中敏24.6%（282/1149），耐药21.4%（246/1149）；2015年对培养出的1101株铜绿假单胞菌进行了药敏试验，其对头孢哌酮钠/舒巴坦钠敏感情况分别为敏感53.1%（585/1101），中敏22.3%（245/1101），耐药24.6%（271/1101）。亚组分析中分离菌株数量较多的病区有重症监护病房、中医科，烧伤整形外科和呼吸内科等病区，其中重症监护病房分离菌株对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药率最高。
　　2.铜绿假单胞菌野生型PAO1对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药后与同步对照组相比，有26个蛋白质高表达，分子量分别为1235Da、4439Da、4538Da、5145Da、6269Da、6569Da、8920Da、8971Da、9081Da、9213Da、9297Da、9380Da、9861Da、10126Da、10946Da、11037 Da、11138Da、11174Da、11255Da、11328Da、11522Da、11573Da、13520Da、13583Da，13647Da和13776Da；有15个蛋白质低表达，分子量分别为3790Da、3910Da、4439Da、5734 Da、5787Da、5880Da、5946Da、6673 Da、6906Da、7576Da、7788Da、8561Da、11731Da，12276Da和12352 Da。
　　3.铜绿假单胞菌野生型PAO1对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药组（实验组）菌株基因组DNA碱基序列与NCBI发表的PAO1标准菌株基因序列进行比对发现有792个突变位点，同步对照组（对照组）菌株基因组DNA碱基序列与NCBI发表的PAO1标准菌株基因序列进行比对发现有141个突变位点，剔除实验组和对照组共同的突变位点，有679个位点仅实验组存在突变，对照NCBI生物信息学数据库对其中42个高质量突变位点所在基因进行分析，发现这些突变均发生在表达酶类、基因转录调控因子等与代谢相关的基因位点上。
　　结论：
　　1.2013-2015年3年间广西医科大学第一附属医院检验科细菌室培养出的铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药率有逐渐上升趋势，中敏率有逐年下降趋势，敏感率有轻微波动，但整体波动不大，不同病区内分离的铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药率不同，但以重症监护病房分离的菌株耐药率最高。
　　2.用蛋白质芯片和SELDI技术对耐头孢哌酮钠/舒巴坦钠前后的铜绿假单胞菌进行蛋白质组学研究，可以筛选出与铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药相关的差异蛋白质。
　　3.铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药后，基因组DNA出现大量的突变；铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的耐药过程是由多个基因、多种机制共同介导的。

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前言

第一部分：铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠的耐药变迁

1.目的

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

6.结论

7.展望

第二部分：铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药相关差异蛋白质组学研究

1.目的

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

6.结论

7.展望

第三部分：铜绿假单胞菌对头孢哌酮钠/舒巴坦钠耐药相关比较基因组学研究

1.目的

2.材料

3.方法

4.结果

5.讨论

6.结论

7.展望

参考文献

附录

综述:铜绿假单胞菌耐药机制及其分子生物学研究新进展

致谢

附表